抗人MxA抗体或其功能性片段及其应用的制作方法

本发明属于生物，涉及基因工程产品，更具体地，本发明公开了一种具有高亲和力的抗人mxa抗体或其功能性片段及其应用。

背景技术：

1、黏病毒抗性蛋白a(myxovirus resistanceprotein，mxa)是由ⅰ型干扰素诱导产生的分布于细胞质中的一种蛋白质，全长mxa蛋白由662个氨基酸组成，分子量为76kd。人类细胞用i型ifn处理会产生两种mx蛋白，分别命名为mxa和mxb。mxa有广谱抗病毒活性，可用于区分机体是否受到病毒感染的特异性指标，而mxb则没有抗病毒活性。大量研究资料表明，mxa具有生物活性稳定，抗病毒作用直接、半衰期较长，特异性好，检测方便等优点。而且mxa蛋白对病毒反应非常敏感甚至极少的病毒量即可诱导细胞表达mxa蛋白，因此mxa蛋白可用于病毒感染的早期诊断，也可用于临床病毒感染与细菌或者其他微生物感染的鉴别诊断。

2、在急诊时，快速检测机体mxa水平，以及快速判别病毒与细菌感染对于疾病诊断、合理用药、评价疗效具有重要意义。目前mxa的临床检测方法有：酶联免疫吸附实验(elisa)、荧光层析法、胶乳增强免疫比浊法。而免疫诊断中抗体的亲和力尤为重要，因此开发一种高亲和力的mxa蛋白具有重大的临床医学应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于采用计算机辅助设计，提供一种高亲和力的抗人mxa抗体或其功能性片段，实现与人mxa蛋白特异性结合，用于体外定量检测人体样本(血清、血浆或全血)中mxa的含量，临床上主要用于病毒感染的辅助诊断。

2、为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现，具体如下：

3、抗人mxa抗体或其功能性片段，包括：

4、cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3、cdr-vl1、cdr-vl2和cdr-vl3，其特征在于，所述cdr-vh1～cdr-vh3为seq id no:1所示重链可变区的cdr-vh1～cdr-vh3一致的氨基酸序列或由其氨基酸序列突变而来，所述突变位点为重链可变区第29、36、62、113、116位；

5、所述cdr-vl1～cdr-vl3为seq id no:2所示轻链可变区的cdr-vl1～cdr-vl3一致的氨基酸序列或由其氨基酸序列突变而来，所述突变位点为轻链可变区第35、36、56、115位氨基酸的位置；

6、所述重链可变区第29、36、62、113、116位和轻链可变区第35、36、56、115位选自下列组合：

7、1)重链可变区第29v、36s、62d、113n、116s和轻链可变区第35g、36w、56k、115p；

8、2)重链可变区第29t、36r、62d、113n、116k和轻链可变区第35g、36n、56k、115p；

9、3)重链可变区第29t、36r、62d、113n、116d和轻链可变区第35g、36n、56k、115p；

10、4)重链可变区第29v、36s、62q、113w、116w和轻链可变区第35g、36r、56k、115p。

11、进一步地，所述cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3、cdr-vl1、cdr-vl2和cdr-vl3由kabat、chothia、imgt、abm或contact系统定义。

12、进一步地，所述cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3、cdr-vl1、cdr-vl2和cdr-vl3由imgt系统定义，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

13、cdr-vh1：g-y-x1-f-t-x2-y-w，

14、cdr-vh2：v-y-p-g-x1-g-d-t，

15、cdr-vh3：a-r-g-y-d-x1-s-f-x2-y，

16、cdr-vl1：q-t-i-v-h-s-n-x1-x2-t-y，

17、cdr-vl2：x1-v-s，

18、和cdr-vl3：f-q-g-s-h-v-x1-p-t，

19、其中

20、

21、本发明发现，在各互补决定区中的上述突变位点为上述氨基酸残基时，该抗体对mxa蛋白具有更好的亲和力。

22、“cdr”在本文中用于指抗体可变序列内的“互补决定区”。重链和轻链的可变区各有3个cdr，从重链或轻链的n端开始。

23、抗原结合位点可以包括六个cdr(本发明中的cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3、cdr-vl1、cdr-vl2和cdr-vl3)。包含单个cdr(例如cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3、cdr-vl1、cdr-vl2和cdr-vl3)的多肽可称为“分子识别单元”。抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明cdr的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链cdr3。因此，分子识别单元可能主要负责抗原结合位点的特异性。一般而言，cdr残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。

24、进一步地，所述抗体包括重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h和轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l，其中，所述fr1-h为如seq id no:3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

25、所述fr2-h为如seq id no:4所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

26、所述fr3-h为如seq id no:5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

27、所述fr4-h为如seq id no:6所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

28、所述fr1-l为如seq id no:7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

29、所述fr2-l为如seq id no:8所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

30、所述fr3-l为如seq id no:9所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

31、所述fr4-l为如seq id no:10所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

32、进一步地，所述抗mxa抗体或其功能性片段还包含恒定区；

33、优选的，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；

34、可选地，所述重链恒定区选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；

35、可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；可选地，所述恒定区的种属来源为小鼠；

36、进一步地，所述功能性片段选自所述抗体的f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种。

37、术语“抗体”包括各种形式的抗体结构，包括但不限于完整抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选是山羊、绵羊、小鼠、兔或大鼠抗体，嵌合抗体或进一步的基因工程抗体，只要保留根据本发明的特征性质。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合部位。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；单链抗体分子；scfv、sc(fv)2；双抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

38、另一方面，本发明公开了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包含所述的抗mxa抗体或其功能性片段以及与其偶联的偶联部分；

39、可选地，所述偶联部分选自纯化标签或可检测的标记，例如胶体金、放射性标记、发光物质、有色物质、酶，例如荧光标记、发色团标记、电子致密标记，例如放射性同位素、荧光团、罗丹明及其衍生物、荧光素酶、荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记中的一种或多种；

40、可选地，所述偶联部分选自固相载体，例如磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。

41、另一方面，本发明公开了一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有所述的抗mxa抗体或其功能性片段。

42、另一方面，本发明公开了如下任一应用，

43、e1)所述的抗mxa抗体或其功能性片段在制备炎症或感染检测试剂或试剂盒中的应用；

44、e2)所述的抗mxa抗体或其功能性片段在流感病毒(influenzavirus)、腺病毒(adv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、副流感病毒(piv)、eb病毒、疱疹病毒(herpes virus)或黏病毒抗性蛋白a病毒检测产品中的应用；

45、e3)所述的抗体偶联物在在制备炎症或感染检测试剂或试剂盒中的应用。

46、另一方面，本发明公开了一种mxa蛋白检测方法，所述检测方法包括权利要求1-6所述的抗mxa抗体或其功能性片段与mxa蛋白结合的过程。

47、有益效果：

48、本发明的目的在于提供一种高亲和力抗人mxa的抗体和检测mxa的方法。本发明提供的抗体可以特异性结合mxa，具有很好的结合活性和亲和力，有利于提高检测的特异性和灵敏度，可用于mxa的检测和mxa水平异常疾病的诊断，为mxa的检测和mxa水平异常疾病的诊断提供更多样的蛋白选择。