一种高产D-泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种高产d-泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、在生物体中，泛酸是酰基载体蛋白和乙酰辅酶a生物合成的重要前体。除此之外泛酸可以在泛酸激酶和丙酮酸脱氢酶的催化下转化为乙酰辅酶a，为细胞的三羧酸循环提供重要的底物。同时，泛酸还在组蛋白的乙酰化以及碳水化合物和脂肪酸等许多物质的合成代谢和分解代谢途径中发挥核心作用，以此协助细胞正常功能的行使。另外，泛酸在对抗压力、维护头发、皮肤及血液健康方面也有重要作用，还有助于体内抗压荷尔蒙的分泌，并且也可以保持皮肤和头发的健康等。

2、作为泛酸及其衍生物的产品在多个领域都具有广泛的应用。在医药领域中，泛酸具有制造抗体的功能，泛酸产品外用还可以治疗多种皮肤病，如鱼鳞病、银屑病、接触性皮炎等；泛酸在动物饲料方面多用作维生素添加剂，添加于家禽、猪、幼龄反刍动物、鱼类等的饲料中，其有助于动物的生长发育、脂肪的合成和分解、能够改善动物毛发、羽毛、鳞片等的色泽；泛酸在化妆品、护肤品里主要作用是保湿剂，皮肤调理剂，具有舒缓抗敏的作用，比较安全。

3、d-泛酸(pantothenicacid)又称为d-泛酸钙、维生素b5，是一种水溶性维生素。d-泛酸的生产方法目前主要有物理诱导结晶法、化学拆分法、化学合成法、生物法等。物理诱导结晶工艺比较成熟，其原理是将混旋的d型和l型的泛酸钙的溶解度大于单一型的泛酸钙的原理，进行诱导结晶，但此方法只能单纯生产泛酸钙，不能用于泛酸的衍生产品，应用面较窄。化学拆分法是目前应用最多的生产方法，化学拆分法是利用手性拆分剂进行拆分得到d-泛酸，但其也存在拆分后分离困难、剩余反应液处理难、手性拆分剂价格昂贵等一系列问题。而化学合成法则是利用泛酸的两个前体β-丙氨酸与d-泛解酸内酯反应得到d-泛酸，但此方法生产d-泛酸时对设备要求较高，前体合成过程中会产生有毒物质，不符合绿色发展需求。

4、利用生物发酵法生产d-泛酸产品，可以利用葡萄糖等廉价的工业原料、经过生物体自身代谢反应而得到d-泛酸产品。生物发酵法利用廉价原料得到高附加值的产物不仅符合发展利益减少生产成本，还具有环境代价小，生产效率高等优点。但生物发酵法存在发酵过程不稳定、产量不高等问题。

技术实现思路

1、为了解决上述生物发酵法生产d-泛酸发酵过程不稳定、产量不高的技术问题，本发明提供了一种高产d-泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明通过改造枯草芽孢杆菌代谢途径，强化泛酸合成前体β-丙氨酸的合成、并减少β-丙氨酸前体支路代谢流，最终使得加强β-丙氨酸的积累，进一步地，最终使得d-泛酸的产量增加。

2、本发明的具体技术方案为：

3、首先，本发明提供了一种高产d-泛酸的基因工程菌。该高产d-泛酸的基因工程菌以枯草芽孢杆菌为底盘菌构建，其构建方法包括以下步骤：

4、(1)过表达底盘菌基因组中的pand、panc、aspb基因；

5、(2)敲除底盘菌基因组中的nadb、gabt基因；

6、(3)在底盘菌中异源表达来源于大肠杆菌的ppc、aspc、aspa、pand基因；

7、(4)在底盘菌中异源表达来源于谷氨酸棒杆菌的panc基因。

8、d-泛酸的合成前体物质主要是泛解酸内酯和β-丙氨酸。在β-丙氨酸合成途径中，糖酵解后得到磷酸烯醇式丙酮酸，接着，磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下合成草酰乙酸，然后草酰乙酸生成天冬氨酸，天冬氨酸转变为β-丙氨酸。在d-泛酸的合成途径中，前体β-丙氨酸是影响d-泛酸产量的一个重要因素。本发明以枯草芽孢杆菌为底盘菌，通过“过表达底盘菌的pand、panc、aspb基因，敲除底盘菌的nadb、gabt基因，在底盘菌中异源表达来源于大肠杆菌的ppc、aspc、aspa、pand基因，在底盘菌中异源表达来源于谷氨酸棒杆菌的panc基因”，可以通过改造β-丙氨酸合成途径，使得枯草芽孢杆菌改造后在无需添加β-丙氨酸的条件下即可高效生产d-泛酸。具体地，改造原理为：

9、本发明通过：(1)引入大肠杆菌外源ppc和aspc基因加强磷酸烯醇式丙酮酸直接转化为草酰乙酸然后转化为l-天冬氨酸，加强β-丙氨酸代谢途径的前体积累；(2)强化d-泛酸合成途径中关键基因pand、panc、aspb基因的表达，加强l-天冬氨酸到β-丙氨酸的转化；(3)敲除l-天冬氨酸代谢旁路中的nadb基因，使得β-丙氨酸前体l-天冬氨酸进一步积累；(4)引入外源大肠杆菌富马酸盐生产l-天冬氨酸中的关键基因aspa基因，增加l-天冬氨酸回补过程中的积累；(5)敲除β-丙氨酸代谢旁路中的gabt基因，使得β-丙氨酸进一步积累；(6)引入外源的谷氨酸棒杆菌的panc基因和来源于大肠杆菌的pand基因，继续增加d-泛酸的合成，最终构建出d-泛酸高产的枯草芽孢杆菌基因工程菌株。

10、同时，本发明提供了上述高产d-泛酸的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：步骤s1：以枯草芽孢杆菌为底盘菌，将大肠杆菌来源的ppc基因引入底盘菌基因组，得到工程菌dpa1；

11、步骤s2：将大肠杆菌来源的aspc基因引入工程菌dpa1基因组，得到工程菌dpa2；

12、步骤s3：过表达工程菌dpa2基因组中的pand基因，得到工程菌dpa3；

13、步骤s4：过表达工程菌dpa3基因组中的panc基因，得到工程菌dpa4；

14、步骤s5：过表达工程菌dpa4基因组中的aspb基因，得到工程菌dpa5；

15、步骤s6：敲除工程菌dpa5基因组中的nadb基因，得到工程菌dpa6；

16、步骤s7：在工程菌dpa6基因组中插入大肠杆菌来源的aspa基因，得到工程菌dpa7；

17、步骤s8：敲除工程菌dpa7基因组中的gabt基因，得到工程菌dpa8；

18、步骤s9：以工程菌dpa8为底盘菌，过表达来源于谷氨酸棒杆菌的panc基因和来源于大肠杆菌的pand基因，得到所述高产d-泛酸的基因工程菌。

19、上述步骤可以通过基因工程的手段实现，如采用cre/loxp基因编辑系统去进行基因的插入或敲除。

20、本发明以枯草芽孢杆菌为底盘菌，通过步骤s1～s9，对底盘菌进行改造，调节d-泛酸的代谢合成路径，提高d-泛酸的产量。首先是引入外源大肠杆菌ppc基因增强草酰乙酸供应量，引入外源大肠杆菌aspc基因加强草酰乙酸转化为l-天冬氨酸的供应量，加强β-丙氨酸代谢途径的前体积累；然后强化d-泛酸合成途径中关键基因pand、panc、aspb基因的表达，加强l-天冬氨酸到β-丙氨酸的转化；敲除l-天冬氨酸代谢旁路中的nadb基因减少其代谢流失；继续引入外源大肠杆菌的aspa基因继续增强其代谢积累；敲除gabt基因，减少l-天冬氨酸的代谢流失；引入外源的谷氨酸棒杆菌的panc基因和来源于大肠杆菌的pand基因，继续增加β-丙氨酸代谢途径到d-泛酸的合成，减少β-丙氨酸途径的代谢流的损失；加强β-丙氨酸代谢途径关键基因表达，最终构建出d-泛酸高产的枯草芽孢杆菌基因工程菌株。

21、作为本发明上述技术方案的优选，步骤s1中，所述枯草芽孢杆菌为bacillussubtilis168。

22、作为本发明上述技术方案的优选，步骤s1中，将大肠杆菌来源的ppc基因引入底盘菌的方式为：用大肠杆菌来源的ppc基因替换底盘菌基因组中的glms基因。

23、进一步优选，大肠杆菌来源的ppc基因的启动子为p43启动子。

24、作为本发明上述技术方案的优选，步骤s2中，将大肠杆菌来源的aspc基因引入工程菌dpa1基因组的方式为：用大肠杆菌来源的aspc基因替换工程菌dpa1基因组中的ybdg基因。

25、进一步优选，大肠杆菌来源的aspc基因的启动子为p43启动子。

26、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

27、本发明以枯草芽孢杆菌为底盘菌，通过改造其代谢途径，一是异源表达来源于大肠杆菌的ppc、aspc基因，然后过表达β-丙氨酸合成途径中的pand、panc、aspb基因，强化泛酸合成前体β-丙氨酸的合成；二是敲除nadb基因，减少β-丙氨酸前体l-天冬氨酸合成途径中支路代谢流；三是异源表达大肠杆菌aspa基因，继续加强β-丙氨酸的积累；四是敲除gabt基因，在减少竞争支路代谢流的基础上进一步弱化了支链有机酸合成途径代谢流；最后利用质粒异源表达来源于大肠杆菌的pand基因和来源于谷氨酸棒杆菌的panc基因，构建得到高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌株。该基因工程菌株的构建，解决了泛酸前体β-丙氨酸在代谢过程中不足的问题，减少外源添加β-丙氨酸的水平，以此减少生产成本。

28、出发菌株在5l发酵中d-泛酸产量从发酵中在不外源添加β-丙氨酸时，产量几乎检测不到。本发明提供的高产d-泛酸的基因工程菌在5l发酵中，发酵72h d-泛酸产量可提高到70.6g/l，产量大大增加。