一种利用基因工程菌全细胞转化生产宝丹酮的方法及应用

本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种利用基因工程菌全细胞转化生产宝丹酮的方法及应用。

背景技术：

1、甾体药物作为目前临床上用量仅次于抗生素的第二类药物，全球年产量已超过100余万吨，据2018年统计数据显示，全球甾体药物市场规模超过1200亿美元。常见的甾体药物中间体分为c19类与c22两类，其中以宝丹酮(bd)、雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(ad)、雄甾烯-1，4-烯-3，17-二酮(add)、9α-羟基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(9α-oh-ad)和睾酮(ts)为主的甾体药物中间体在医药领域市场的需求逐年上升。

2、宝丹酮(bd)是雄激素合成代谢类固醇和睾丸激素(ts)衍生物，可促进蛋白质合成，支持氮潴留并刺激肾脏促红细胞生成素释放。bd通常是由雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(ad)或1，4-雄烯二酮(add)通过化学合成制得的。然而，存在合成路线繁琐、需要添加强酸或有毒试剂、副产物多、产率低以及成本高等缺陷。此外，化学法合成宝丹酮的过程中会产生大量的三废，这些废气废水废料会严重污染环境，不符合国家环保需求。微生物转化法具有高立体选择性、绿色环保等优点，已逐渐在甾体药物中间体的应用中发挥着越来越大的作用，近年来通过生物合成bd成了研究的热点。

3、17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase，17β-hsd)，是一类依赖nad(p)h/nad(p)+的氧化还原酶，能够催化甾体中c-17的羟基与酮基之间的相互转化。葡萄糖6-磷酸脱氢酶g6pdh是磷酸戊糖氧化途径中的限制性酶，可以催化葡萄糖-6-磷酸氧化为6-磷酸葡萄糖内酯，同时nadp+还原为nadph。作为细胞内nadph再生的重要酶之一，g6pdh的过表达已被广泛应用于体内代谢工程中补充nadph。例如邵明龙等在毕赤酵母中共表达人17β-羟基类固醇脱氢酶3型和酿酒酵母的葡萄糖6-磷酸脱氢酶，睾酮的生产提高了67.6％，因此可运用17β-hsd与g6pdh共表达构建辅酶再生系统。

4、许多微生物利用雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(add)作为底物通过17β-羟基类固醇脱氢酶还原反应以产生bd，但该类酶在多数微生物中酶活力不高，难以用于有竞争力的商业化过程。同时，该类酶还常受微生物体内的营养状态调控，会在营养贫乏时强化逆反应，重新把还原的羟基氧化为酮基，使得最终的转化率较低，不利于分离纯化。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明旨在提供新的合适的具有高催化活性的17β-羟基类固醇脱氢酶，并建立对宝丹酮程绿色环保、产品收率、质量成本具有商业化竞争力的全细胞转化生产策略，具体技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种来源于brettanomycesnaardenensis的17β-羟基类固醇脱氢酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2、第二方面，本发明提供了一种编码所述17β-羟基类固醇脱氢酶的基因。

3、第三方面，本发明提供了一种包含所述17β-羟基类固醇脱氢酶编码基因的载体。

4、第四方面，本发明提供了一种包含所述的17β-羟基类固醇脱氢酶编码基因的基因工程菌。

5、进一步地，所述基因工程菌以大肠杆菌或分枝杆菌为宿主菌。

6、进一步地，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)。

7、进一步地，分枝杆菌为快速生长型分枝杆菌，包括耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌、新金分枝杆菌。

8、进一步地，所述分枝杆菌选择mycobacterium sp.nrrl b-3805。

9、第五方面，本发明提供了一种全细胞转化生产宝丹酮基因工程菌的方法，包括如下步骤：

10、s1：合成氨基酸序列如seq id no.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶的编码基因，

11、s2：选择质粒上酶切位点对质粒进行酶切，将合成基因与载体连接；

12、s3：将步骤s2中的重组载体质粒转化到细胞中，筛选验证后得到基因工程菌。

13、进一步地，构建重组大肠杆菌的方法，包括如下步骤：

14、s1：合成brettanomyces naardenensis(gen bank id:veu22018.1)17β-hsdbn序列(seq id no.1)，

15、s2：选择pet28a(+)质粒上酶切位点(bamhi和xhoi)对质粒进行酶切，将合成基因与载体连接，

16、s3：转化到e.coli bl21(de3)感受态细胞中，筛选验证后即构成重组工程菌e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-17βhsdbn。

17、进一步地，构建重组分枝杆菌的方法，包括如下步骤：

18、s1：以新金色分枝杆菌mycobacterium sp.nrrl b-3805为底盘菌，敲除ksha1、mnopccr、sala基因，得到菌株mn 3805△kms；

19、s2：将核苷酸序列如seq id no.3所示的携带核糖体结合位点rbs(cggagga)的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因、氨基酸序列如seq id no.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶的编码基因连接至载体质粒，得到重组载体质粒；

20、s3：将步骤s2中的重组载体质粒转化至步骤s1中的菌株mn 3805△kms，得到高产宝丹酮基因工程菌。

21、进一步地，所述g6pdh来源于mycobacterium sp.nrrl b-3805。

22、第六方面，本发明提供了如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶，或如权利要求3所述的载体，或如权利要求4、5、6中任一项所述的工程菌在催化甾体中c-17的羟基与酮基之间相互转化的反应中的应用。

23、第七方面，本发明提供了如所述的17β-羟基类固醇脱氢酶，或如所述的载体，或如权利要求4、5、6中任一项所述的工程菌在合成宝丹酮中的应用。

24、第八方面，本发明提供了一种全细胞转化生产宝丹酮的方法，具体包括如下步骤：将雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮、植物甾醇在所述的17β-羟基类固醇脱氢酶的作用下，生成宝丹酮，如下式所示：

25、

26、进一步地，一种利用重组大肠杆菌制备宝丹酮的方法，其以核苷酸序列如seq idno.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶为催化剂，以雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(add)作为底物制备宝丹酮。具体制备方法为：采用5-10m l反应体系，50-55m m、ph7.5-8.0的pbs缓冲液垂悬重组大肠杆菌至菌体湿重为150-200g/l，加入1.0-2.5g/l的葡萄糖，0.5-2mm nadph，0.5-1.0g/l底物add进行转化，转化温度为30-37℃，转化ph为7.5-8.0，底物助溶剂为羟丙基-β-环糊精、1-2％吐温80，所述add：羟丙基-β-环糊精质量的比为1:3。

27、进一步地，一种重组分枝杆菌制备宝丹酮的方法，其以核苷酸序列如seq id no.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶为催化剂，以植物甾醇作为底物制备宝丹酮。

28、本发明具有如下有益效果：

29、(1)本发明首次鉴定出brettanomyces naardenensis来源的17β-hsd具有17β-羟基甾体脱氢酶功能，并成功构建了表达真菌来源的17β-羟基类固醇脱氢酶的重组大肠杆菌及重组分枝杆菌；

30、(2)以本发明提供的重组工程菌全细胞为催化剂生产宝丹酮，其转化速度快，转化率高；

31、(3)本发明提供的微生物全细胞生产宝丹酮的方法，具有反应条件温和、绿色环保、产品收率高、工艺简单、易于控制等优点，更适合工业应用。