一种鉴别结核分枝杆菌和NTM菌的多重qPCR检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及基因诊断领域，具体地说涉及一种鉴别结核分枝杆菌和ntm菌的多重qpcr检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、结核病是由结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex,mtc)，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌等经呼吸道传播而引起的全身性慢性传染病，又被称为“白色瘟疫”，在世界范围内广泛流行。结核分枝杆菌致病性较强，感染后常导致组织细胞病变、长期感染出现咳嗽、低热、呼吸困难的症状。非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,ntm)，即除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，在环境中广泛存在，不同菌种之间致病力存在区别。临床样本菌株分离情况显示脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌等十余种ntm菌可通过呼吸道、胃肠道、皮肤等途径入侵人体，对社会带来公共健康危害。

2、结核病属慢性病，通常采用药物治疗。利福平、异烟肼、喹诺酮类等一线抗结核药物与其他抗生素组合对大多数非耐药结核病患者有较好的治疗效果。患者感染ntm菌时，由于临床症状与结核分枝杆菌病相似，极易导致误诊，错误用药可能会加速细菌产生耐药性导致治疗失败甚至造成终身不愈的后果。快速鉴别病原体，指导医生临床用药，可以减少细菌产生耐药性的风险，因此mtc/ntm分型检测受到重视。

3、由于大多数ntm病与结核病症状相似，凭借常规诊断方法难以区分。在临床诊疗中常采用涂片显微镜检查，此方法对菌液浓度要求较高，临床样本常出现假阴性结果；另一方法为菌种分离培养，此方法的优势在于可通过培养富集菌落，检测灵敏度相对较高，但该方法也存在缺点，慢速生长型分枝杆菌往往需要2～3周才可以形成肉眼可见的菌落，溃疡分枝杆菌的培养周期则长达8周，另外漫长的实验周期也增大了操作人员暴露感染的可能，为缩短诊断时间，更多新技术被应用于分枝杆菌病检测。

4、分子诊断技术以基因为检测靶点，qpcr技术是分子诊断技术中较为成熟的一种，在两条引物的基础上加入一条taqman探针，与特异性位点结合后利用taq酶的切割活性释放荧光基团，机器实时采集荧光信号后呈现图像结果，检测时间通常在2h以内，具有快速检测，灵敏度高和特异性强的特点。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种灵敏度的用于检测区分结核分枝杆菌与多种ntm菌(胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌和脓肿分枝杆菌)的检测试剂盒；本发明还有一个目的是提供该试剂盒基于多重qpcr检测在鉴别结核分枝杆菌与多种ntm菌上的应用。

2、技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种检测试剂盒包括用于四重qpcr检测的特异性探针和内标基因引物探针，所述特异性探针包括结核分枝杆菌探针、脓肿分枝杆菌探针、堪萨斯分枝杆菌探针、蟾蜍分枝杆菌探针、鸟分枝杆菌探针、龟分枝杆菌探针、偶发分枝杆菌探针、耻垢分枝杆菌探针、海分枝杆菌探针、戈登分枝杆菌探针、胞内分枝杆菌探针、瘰疬分枝杆菌探针。

3、进一步地，所述特异性探针包括：结核分枝杆菌探针，具有如seq id no:1所示的核苷酸序列；脓肿分枝杆菌探针；具有如seq id no:2所示的核苷酸序列；堪萨斯分枝杆菌探针；具有如seq id no:3所示的核苷酸序列；蟾蜍分枝杆菌探针；具有如seq id no:4所示的核苷酸序列；鸟分枝杆菌探针；具有如seq id no:5所示的核苷酸序列；龟分枝杆菌探针；具有如seq id no:6所示的核苷酸序列；偶发分枝杆菌探针；具有如seq id no:7所示的核苷酸序列；耻垢分枝杆菌探针；具有如seq id no:8所示的核苷酸序列；海分枝杆菌探针；具有如seq id no:9所示的核苷酸序列；戈登分枝杆菌探针；具有如seq id no:10所示的核苷酸序列；胞内分枝杆菌探针；具有如seq id no:11所示的核苷酸序列；瘰疬分枝杆菌探针，具有如seq id no:12所示的核苷酸序列；其中，任意数量的所述特异性探针具有5’端荧光基团修饰和/或3’端淬灭基团修饰。

4、进一步地，所述荧光基团选自包括但不限于fam、vic、rox、cy5的任意一种；所述淬灭基团选自包括但不限于bhq1、bhq2的任意一种。

5、作为本发明的优选方案，所述特异性探针包括：

6、结核分枝杆菌探针：aaagacgtcacaagcgagccgta，

7、脓肿分枝杆菌探针：rox-gcgggcgaccagt+ccatcg-bhq2，

8、堪萨斯分枝杆菌探针：fam-tgt+ttgag+aattggat-bhq1，

9、蟾蜍分枝杆菌探针：rox-tgg+tggtgttgtgc+tcc-bhq2，

10、鸟分枝杆菌探针：vic-caccg+aggtcgcggc+cttc-bhq1，

11、龟分枝杆菌探针：vic-tcgagaaggc+cgtggaggcc-bhq1，

12、偶发分枝杆菌探针：fam-tagtgggc+acggt+ttggt-bhq1，

13、耻垢分枝杆菌探针：rox-catctagt+tcgtaagagtg-bhq2，

14、海分枝杆菌探针：fam-acc+agctc+cgcgaca+aga-bhq1，

15、戈登分枝杆菌探针：vic-acac+cctcgggtg+ctgtc-bhq1，

16、胞内分枝杆菌探针：vic-tggtgt+ttgagt+attg-bhq1，

17、瘰疬分枝杆菌探针：rox-acgatcaggttc+tgggcgga-bhq2；

18、其中，序列中的“+”表示其右侧碱基具有锁核酸修饰。

19、锁核酸修饰(lna)是一种双环状核苷酸衍生物，其结构与核苷酸相似，对dna和rna均有较好的亲和活性，由于lna与dna或rna互补双链具有很强的热稳定性，在寡核苷酸中掺入一个lna碱基就可以使溶解温度升高4℃～9℃。相比常规的taqman探针具有更好的特异性，减少了假阳性结果出现的概率，进一步的提升了检测的准确性。基于该方案获得的特异性探针具有不低于90％的特异性，优选不低于95％的特异性。

20、作为本发明的优选方案，所述特异性探针包括：

21、结核分枝杆菌探针：aaagacgtcacaagcgagccgta，上游引物的核苷酸序列如seq idno:13所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:14所示；

22、脓肿分枝杆菌探针：rox-gcgggcgaccagt+ccatcg-bhq2，上游引物的核苷酸序列如seq id no:15所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:16所示；

23、堪萨斯分枝杆菌探针：fam-tgt+ttgag+aattggat-bhq1，上游引物的核苷酸序列如seq id no:17所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:18所示；

24、蟾蜍分枝杆菌探针：rox-tgg+tggtgttgtgc+tcc-bhq2，上游引物的核苷酸序列如seq id no:19所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:20所示；

25、鸟分枝杆菌探针：vic-caccg+aggtcgcggc+cttc-bhq1，上游引物的核苷酸序列如seq id no:21所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:22所示；

26、龟分枝杆菌探针：vic-tcgagaaggc+cgtggaggcc-bhq1，上游引物的核苷酸序列如seq id no:23所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:24所示；

27、偶发分枝杆菌探针：fam-tagtgggc+acggt+ttggt-bhq1，上游引物的核苷酸序列如seq id no:25所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:26所示；

28、耻垢分枝杆菌探针：rox-catctagt+tcgtaagagtg-bhq2，上游引物的核苷酸序列如seq id no:27所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:28所示；

29、海分枝杆菌探针：fam-acc+agctc+cgcgaca+aga-bhq1，上游引物的核苷酸序列如seq id no:29所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:30所示；

30、戈登分枝杆菌探针：vic-acac+cctcgggtg+ctgtc-bhq1，上游引物的核苷酸序列如seq id no:31所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:32所示；

31、胞内分枝杆菌探针：vic-tggtgt+ttgagt+attg-bhq1，上游引物的核苷酸序列如seq id no:33所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:34所示；

32、瘰疬分枝杆菌探针：rox-acgatcaggttc+tgggcgga-bhq2，上游引物的核苷酸序列如seq id no:35所示，上游引物的核苷酸序列如seq id no:36所示；

33、其中，序列中的“+”表示其右侧碱基具有锁核酸修饰。

34、利用上述检测试剂盒可用于鉴别结核分枝杆菌与多种ntm菌。根据荧光基团不同，组成四重qpcr反应体系。所述反应体系中包括1对内标基因枯草芽孢杆菌引物探针和3对分枝杆菌引物探针，通过4个反应孔完成病原核酸检测。其中优选的多重反应体系引物探针组合包括：

35、第1组(反应孔1)：内标基因引物探针、结核分枝杆菌引物探针、胞内分枝杆菌引物探针、蟾蜍分枝杆菌引物探针；

36、第2组(反应孔2)：内标基因引物探针、堪萨斯分枝杆菌引物探针、鸟分枝杆菌引物探针、瘰疬分枝杆菌引物探针；

37、第3组(反应孔3)：内标基因引物探针、偶发分枝杆菌引物探针、龟分枝杆菌引物探针、耻垢分枝杆菌引物探针；

38、第4组(反应孔4)：内标基因引物探针、海分枝杆菌引物探针、戈登分枝杆菌引物探针、脓肿分枝杆菌引物探针。

39、本发明提供了可用于区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的实时荧光定量pcr引物和锁核酸修饰探针、引物探针组合及其应用，具有高灵敏度、高特异性的特点，可准确区分结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌、脓肿分枝杆菌共12种病原菌，各组分的引物探针可根据需求组合使用，亦可一次反应同时检测12种核酸。

40、同时本发明旨在提高检测性能的同时，也通过优化试剂的反应体系的方式缩短了检测时间，为结核/非结核分枝杆菌核酸检测提供了一种检测速度快、覆盖范围广、特异性较好、灵敏度较高的方案。

41、本发明进一步优化了试剂反应体系。设计了12组检测分枝杆菌的引物探针，共使用4种荧光基团修饰探针，实现单一反应孔内检测4个靶基因，在加入内标基因引物探针的前提下，可使用4个反应管，在一次反应中同时检测11种非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌核酸。相比同种类型的探针法半巢式qpcr检测和溶解曲线法检测，本方法的检测时间可大幅度缩短，从2h左右的检测时间缩短到了50min以内，减少了患者的等待时间。

42、本方法与市面常见的免疫学方法相比，本发明在提升了检测灵敏度的同时，增添了可对11种常见ntm菌核酸分型的功能，给出的检测报告更具有临床价值。另外本发明使用了lna核酸修饰探针，相比常规的taqman探针具有更好的特异性，减少了假阳性结果出现的概率，进一步的提升了检测的准确性。