一种骨髓液DNA提取试剂盒及其制备方法与流程

本发明属于dna提取领域，具体公开了针对骨髓液dna的提取试剂盒及其制备方法和使用方法。

背景技术：

1、血液肿瘤中越来越多的分子异常作为诊断、分型、亚型鉴别的重要依据。单纯依靠传统micm检测技术，难以胜任对血液肿瘤分型有重要意义分子标志的检测任务。ngs技术有着独特的高通量检测优势。ngs技术在血液肿瘤中的应用领域包括：诊断分型、预后判定、知道治疗、微小残留病灶(mrd)监测、克隆演变。核型异常和基因突变对指导治疗和判断患者的预后有重要意义，并已成为who分型的重要依据。2018年二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识中建议，疑诊为血液肿瘤的患者，初诊时应留存新鲜骨髓、外周血或组织样本，以备进行ngs检测，未留存者可使用初诊时的骨髓涂片进行检测。骨髓采集量以1～3ml为宜，外周血采集量3～5ml为宜，若白细胞计数偏高或偏低，应适当调整采集量，使单个核细胞总数达到1×107以上。血液肿瘤相关ngs测序中文库制备的方法有两种，扩增子方法建库简单、建库速度较快、测序仪数据量利用率高、建库及测序成本相对较低、建库模板量要求低；探针捕获方法适用大组套检测、高gc区域覆盖度更好、大片段插入缺失突变检出率高。其中扩增子建库对dna纯度要求较高。

2、骨髓是存在于长骨(如肱骨、股骨)的骨髓腔，扁平骨(如髂骨、肋骨)和不规则骨(胸骨、脊椎骨等)的松质骨间网眼中的一种海绵状的组织，能产生血细胞的骨髓略呈红色，称为红骨髓。人出生时，全身骨髓腔内充满红骨髓，随着年龄增长，骨髓中脂肪细胞增多，相当部分红骨髓被黄骨髓取代，最后几乎只有扁平骨松质骨中有红骨髓。白血病与非霍奇金淋巴瘤高发于60岁以上老年人，送检于ngs检测的骨髓样本中血脂与血糖常高于正常骨髓样本。相当一部分血液病如骨髓增生异常综合征(mds)、再生障碍性贫血(aa)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)会引起全血细胞减少，导致骨髓中白细胞数量降低。因此实验室收到的患者骨髓样本的异质性很高。此外，骨髓纤维化和用药等均会影响骨髓样本的基因组dna提取质量与浓度。

3、目前ngs实验室中使用的核酸提取试剂是全血细胞基因组核酸抽提试剂，用于大批量提取的核酸提取仪器及其配套试剂也是基于全血样本。在使用全血样本提取试剂盒提取患者骨髓样本时，常出现样本过于粘稠，无法消化和洗脱或者样本白细胞过低，需要大体积的样本去提取等问题。使用常规厂家生产的试剂盒时会出现提取的dna纯度过低，构建文库质量不合格，难以上机测序的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术不足，本文公开了一种骨髓液dna提取试剂盒及其制备方法可以提取患者骨髓样本中的基因组dna，得到的核酸纯度高，稳定性好，可以用于多种建库方法。

2、本发明包括以下技术方案：

3、一种骨髓液dna提取试剂盒,包括tris-hcl缓冲液(ph7.5)、细胞裂解液、蛋白酶k试剂、核糖核酸酶试剂、洗涤液一、洗涤液二、洗脱液和离心管。

4、进一步的，上述一种骨髓液dna提取试剂盒，所述蛋白酶k试剂由以下步骤制备：将200mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶k完全溶解，加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

5、进一步的，上述一种骨髓液dna提取试剂盒，所述核糖核酸酶试剂由以下步骤制备：将核糖核酸酶溶于10mm tris·hcl(ph7.5)和15mm nacl中，配成10mg/ml浓度母液，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

6、进一步的，上述一种骨髓液dna提取试剂盒，所述细胞裂解液由以下重量份的原料组成：

7、

8、进一步的，上述一种骨髓液dna提取试剂盒，所述离子型表面活性剂选自硬脂酸、十六烷基硫酸钠和苯扎溴铵中的一种；所述非离子型表面活性剂选自月桂山梨坦、聚氧乙烯脱水山梨醇单棕榈酸酯和硬脂山梨坦中的一种。

9、进一步的，上述一种骨髓液dna提取试剂盒，所述洗涤液一由以下重量份的原料组成：

10、注射用水                         100份

11、tris-hcl                         5-10份

12、无水乙醇                         50-80份。

13、进一步的，上述一种骨髓液dna提取试剂盒，所述洗涤液二由以下重量份的原料组成：

14、注射用水                         100份

15、氯化钠                           15-25份

16、无水乙醇                         100-120份。

17、进一步的，上述一种骨髓液dna提取试剂盒，所述洗脱液由以下重量份的原料组成：

18、注射用水                         100份

19、tris-hcl                         10-15份

20、edta                             3-6份。

21、进一步的，上述一种骨髓液dna提取试剂盒的使用方法，所述方法为非诊断或者治疗目的的，所述方法包括以下步骤：

22、步骤一：取50～200ul新鲜骨髓液样本于1.5ml离心管中，然后向该离心管中加入0.3倍体积的tris-hcl缓冲液，震荡混匀1min，室温静置10min，加入离心机，2000rpm低速离心5min，吸弃上层液体；

23、步骤二：再向每个1.5m离心管中加入等于骨髓液样本5-10倍体积的细胞裂解液，手动振荡混匀，4℃放置20～30min后，2000rpm低速离心15min；离心结束后，吸弃上清液；

24、步骤三：向上述沉淀中加入20ul蛋白酶k试剂，吹打混匀后，转移至2.0ml离心管中，55℃水浴0.5～2h，沉淀消失后37℃水浴过夜；

25、步骤四：向水浴过夜后的混合液中加入800μl核糖核酸酶试剂，振荡混匀，60℃放置1-2h；然后13000rpm高速离心10min，将离心后的上清液倒入新的2.0ml离心管中；

26、步骤五：向离心管中加入500～800ul洗涤液一和洗涤液二，将该离心管震荡混匀1min，静置30s后，然后吸弃上清液,

27、步骤六：加入30～60ul洗脱液，放置2min，12000rpm，离心2min，收集液体，即为dna溶液。

28、进一步的，上述骨髓液dna提取试剂盒在高通量测序ngs中的应用。

29、本发明具有以下有益效果：

30、市场上一般没有专用于骨髓液提取的试剂盒，用全血基因组dna提取骨髓样本会出现不适配的情况，粘稠度较高的骨髓样本无法正常提取，出现磁珠法提取时磁珠与样本结合后磁珠无法正常洗脱或洗脱效果差；柱法提取时未消化的杂质留在吸附柱上，洗脱的dna质量差。提取的dna质量差，对后续的建库及上机流程有影响，导致出现测序质量差、假阳性等后果。

31、本发明公开的专用于骨髓样本的试剂，在裂解步骤充分消化骨髓样本，降低高血糖血脂对提取过程的影响，得到的核酸纯度高，稳定性好；能降低实验人员骨髓样本提取难度，提高骨髓样本提取效率，为血液肿瘤ngs检测提供可靠的骨髓nda样本。