一种鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统及其应用

本发明涉及一种鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统及其应用，属于基因工程领域。

背景技术：

1、相对于小鼠、果蝇等模式生物，家蚕蛋白的商业化抗体很少，而蛋白抗体定制不仅时间长，且价格昂贵，对co-ip、pull-down等蛋白互作实验造成一定障碍。因此开发一种高效快捷的家蚕融合蛋白表达系统至关重要。再者家蚕细胞贴壁性差，生长速度较慢，不易频繁处理，因此开发高效、直接可见的蛋白表达载体对于细胞水平的科学研究非常有必要。

2、piz-v5-his载体含组成型表达的opie2启动子，是常用的昆虫细胞表达载体。该载体c-端v5抗原决定簇和聚组氨酸(6xhis)序列，可用v5抗体进行检测，并采用镍螯合树脂进行快速纯化，是理想的标签融合质粒，但是该载体无荧光标记。再者该载体的zeocin抗性基因可用于快速选择稳定转染的细胞系，但是家蚕bmn细胞对zeocin比较敏感，导致稳定转染细胞系的筛选困难，直接的观察到高效表达对家蚕细胞来说更加行之有效。目前家蚕bmn细胞中使用的荧光表达载体具有很大的局限性。三个明显的缺陷在于，其一如pizt/v5-his载体虽表达荧光，但是目标蛋白与荧光非融合；其二如现有的一些荧光表达载体，没有充分考虑酶切位点利用的效率；其三没有能在同一细胞中表达双重荧光的体系，使得蛋白表达既可视又可检测。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供了一种鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统。本发明的第二目的是提供了上述鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统的构建方法。本发明的第三目的是提供了上述鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统的应用。本发明的第四目的是提供了一种检测两种蛋白是否相互作用的方法。

2、技术方案：本发明的一种鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统，所述双荧光蛋白共表达系统包括重组载体1和重组载体2，重组载体1为插入egfp基因片段的piz-v5-his载体，所述egfp基因片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；重组载体2为插入mcherry基因片段的piz-v5-his载体，所述mcherry基因片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明不仅综合利用了egfp和mcherry的双重荧光特性，而且将位点设计在质粒酶切位点骨架的最前端，有非常高的酶切位点利用率，尤其对与插入序列含比较多的内部酶切位点时，有更大的选择性。

4、本发明的一种上述鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统的构建方法，包括以下步骤：

5、(1)以pegfp-n3质粒为模版，pcr扩增得到egfp基因片段，所述egfp基因片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；以pcmv-c-mcherry质粒为模版，pcr扩增得到mcherry基因片段，所述mcherry基因片段的核苷酸序列如seq id no.2所示；

6、(2)分别用hindiii和bamhi对egfp基因片段、mcherry基因片段和piz-v5-his进行双酶切，然后将egfp基因片段和mcherry基因片段分别与piz-v5-his载体连接，即得重组载体piz-egfp-v5-his和piz-mcherry-v5-his。

7、进一步地，步骤(1)中pcr扩增egfp基因片段和mcherry基因片段所使用的引物对核苷酸序列如seq id no.3～4所示。

8、本发明的一种上述鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统在检测两种蛋白是否相互作用中的应用。

9、进一步地，所述蛋白为co-ip或pull-down蛋白。

10、本发明的一种检测两种蛋白是否相互作用的方法，包括以下步骤：将两种待测蛋白的基因片段分别插入上述系统中的不同重组载体中，然后等比例混合共转染宿主细胞，观察转染后细胞的荧光蛋白表达情况，，若可观察到红/绿荧光，则该系统可用于两种待测蛋白相互作用检测；若只能观察到红色荧光或绿色荧光，则该系统不可用于两种待测蛋白相互作用检测。

11、进一步地，所述宿主细胞为bmn细胞。

12、进一步地，所述待测蛋白为bmp53蛋白和mdm2-like蛋白。

13、所述bmp53蛋白的插入基因片段的核苷酸序列如seq id no.9所示，mdm2-like蛋白的插入基因片段的核苷酸序列如seq id no.10所示。

14、进一步地，扩增bmp53蛋白的插入基因片段所使用的引物对核苷酸序列如seq idno.5～6所示；扩增mdm2-like蛋白的插入基因片段所使用的引物对核苷酸序列如seq idno.7～8所示。

15、进一步地，所述bmp53蛋白的基因片段插入位点为bamhi和xhoi，mdm2-like蛋白的基因片段插入位点为ecori和xhoi。

16、bmp53蛋白的基因片段插入位点选为bamhi和xhoi，可以最大程度减少荧光蛋白、bmp53和c-端v5-his标签之前的无效氨基酸序列。

17、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明的鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统，在piz-v5-his载体中分别插入egfp、mcherry基因，设计的egfp和mcherry插入酶切位点靠前位置(hindiii和bamhi位点)，实现荧光蛋白融合的同时最大限度提高载体骨架酶切位点的利用率；重组后的表达载体可在家蚕bmn细胞中启动表达绿色或红色双荧光融合蛋白，可用于蛋白检测和互作等功能研究，实现待测蛋白表达和定位可视化，且可利用egfp和mcherry蛋白抗体检测蛋白表达和互作。本发明的双荧光蛋白共表达系统用于表达家蚕凋亡调控蛋白bmp53和潜在泛素化蛋白mdm2-like，成功使上述两种蛋白的表达、定位、互作可视化。

技术特征：

1.一种鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统，其特征在于，所述双荧光蛋白共表达系统包括重组载体1和重组载体2，重组载体1为插入egfp基因片段的piz-v5-his载体，所述egfp基因片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；重组载体2为插入mcherry基因片段的piz-v5-his载体，，所述mcherry基因片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.一种权利要求1所述的鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中pcr扩增egfp基因片段和mcherry基因片段所使用的引物对核苷酸序列如seq id no.3～4所示。

4.一种权利要求1所述的鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统在检测两种蛋白是否相互作用中的应用。

5.一种检测两种蛋白是否相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：将两种待测蛋白的基因片段分别插入权利要求1所述系统中的不同重组载体中，然后等比例混合共转染宿主细胞，观察转染后细胞的荧光蛋白表达情况，若可观察到红/绿荧光，则该系统可用于两种待测蛋白相互作用检测；若只能观察到红色荧光或绿色荧光，则该系统不可用于两种待测蛋白相互作用检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为bmn细胞。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测蛋白为bmp53蛋白和mdm2-like蛋白。

8.根据权利要7所述的方法，其特征在于，所述bmp53蛋白的插入基因片段的核苷酸序列如seq id no.9所示，mdm2-like蛋白的插入基因片段的核苷酸序列如seq id no.10所示。

9.根据权利要8所述的方法，其特征在于，扩增bmp53蛋白的插入基因片段所使用的引物对核苷酸序列如seq id no.5～6所示；扩增mdm2-like蛋白的插入基因片段所使用的引物对核苷酸序列如seq id no.7～8所示。

10.根据权利要7所述的方法，其特征在于，所述bmp53蛋白的基因片段插入位点为bamhi和xhoi，mdm2-like蛋白的基因片段插入位点为ecori和xhoi。

技术总结
本发明公开了一种鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统及其应用。所述双荧光蛋白共表达系统包括分别插入EGFP基因片段或mCherry基因片段的pIZ‑V5‑His载体后的重组载体，所述EGFP基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述mCherry基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的鳞翅目昆虫细胞用双荧光蛋白共表达系统，在pIZ‑V5‑His载体中分别插入EGFP、mCherry基因，设计的EGFP和mCherry插入酶切位点靠前位置(HindIII和BamHI位点)，实现荧光蛋白融合的同时最大限度提高载体骨架酶切位点的利用率；重组后的表达载体可在家蚕BmN细胞中启动表达绿色或红色双荧光融合蛋白，可用于蛋白检测和互作等功能研究，实现待测蛋白表达和定位可视化，且可利用EGFP和mCherry蛋白的抗体检测蛋白表达和互作。

技术研发人员：王梅仙,夏素萍,郑思敏,韩丁丁,王嘉豪,沈兴家
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1