基于One-TubeRPA-CRISPR/Cas12a的腺病毒快速检测方法

本发明属于生物，具体涉及基于one-tube rpa-crispr/cas12a的腺病毒快速检测方法。

背景技术：

1、腺病毒(adenovirus，adv)是一种无包膜的双链dna病毒，人腺病毒(humanadenovirus，hadv)是哺乳动物adv属中的一员，目前已经发现了7个亚群(hadv-a至hadv-g)，包含有69种血清型和70多个基因型。通常会引起上、下呼吸道，胃肠道和结膜等的轻度感染，症状严重时或特定情况下(免疫功能低下患者)会出现血性膀胱炎、肝炎、出血性结肠炎、胰腺炎、肾炎或脑炎，死亡率可能超过50％。由于缺乏体液免疫，幼儿是hadv的感染多发年龄段，并且在封闭或拥挤环境中的健康儿童或成人(特别是新兵)感染的概率更高。因此，在腺病毒感染的早期能够将其快速的诊断，是有效治疗患者、降低死亡率的重要手段。

2、核酸检测技术因其特异性好、灵敏度高的优点越来越受到各大医院和诊断实验室的青睐。但是，基于聚合酶链式反应(pcr)原理的一系列核酸检测技术，受限制于变温控制模块，通常使得仪器庞大不便于携带至临床边和疫区现场，或又因其昂贵的设备价格难以普及至偏远地区。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)技术是由重组酶与聚合酶催化，在37～42℃的恒温条件下对靶标dna特异片段进行扩增的一项技术，因其快速、简便、等温而成为现场诊断的首选扩增技术。此外，基于crispr(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)-cas(crispr associated)系统中的cas12a和cas13a而开发的体外诊断技术(detectr和sherlock)被证实能够有效的检测病原微生物，具有良好的特异性和可靠性。因为cas12a-crrna能够识别单链或双链dna，不需要将底物dna转换成rna而省去了转录步骤。因此，基于rpa前扩增的crispr/cas12a技术用于dna病毒的核酸检测操作会更加简便。

3、传统的两步法rpa-crispr/cas12a检测技术包含前扩增子的转移和多种人工操作，使测试过程复杂化，在扩增产物的转移过程中有造成气溶胶污染的风险。而提前将靶标dna、rpa试剂和crispr试剂加入一管的检测方法，可以减少二次开盖带来的气溶胶污染且对灵敏度没有影响，在恒定的温度下保持一段时间即可完成检测，更加方便快捷。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何精准、灵敏、方便、快速地检测腺病毒。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测腺病毒的引物对，所述引物对可为特异性扩增腺病毒检测靶标基因的一对引物，所述腺病毒检测靶标基因的核苷酸序列可为seq id no.1。

3、进一步地，所述引物对可由引物ade-f1和引物ade-r4组成，所述引物ade-f1可为seq id no.2所示的单链dna分子；所述引物ade-r4可为seq id no.9所示的单链dna分子。

4、本发明还提供了用于检测腺病毒的组合物，所述组合物可包括所述引物对和crrna，所述crrna的序列可由锚定序列和向导序列组成，所述向导序列可为seq id no.12的第22-45位。

5、上述组合物中，所述crrna的核苷酸序列可为seq id no.12。

6、进一步地，所述组合物还可包括探针(名称为exorpa-p)，所述探针exorpa-p的核苷酸序列可为seq id no.10。

7、进一步地，所述探针(seq id no.10)的第31位碱基t可标记fam，第33位碱基g可用四氢呋喃(thf)取代，第34位碱基t可标记淬灭基团bhq1。

8、进一步地，所述探针exorpa-p的3’端可标记c3-spacer。

9、上述组合物中，所述组合物还可包括ssdna和/或cas12a蛋白，所述ssdna可为两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团的报告分子。

10、进一步地，所述ssdna的核苷酸序列可为seq id no.11。

11、进一步地，所述ssdna的5’端可标记荧光基团，3’端可标记淬灭基团。

12、进一步地，所述荧光基团可选自fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe、fitc、tet、ned、tamra、lc red640、lc red705、quasar705或texas red中的至少一种。

13、进一步地，所述淬灭基团可选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcy1中的至少一种。

14、进一步地，所述ssdna的5’端可标记fam，3’端可标记bhq1。

15、本发明还提供了用于检测腺病毒的试剂盒，所述试剂盒可包括所述引物对，或包括本文中任一所述的组合物。

16、进一步地，所述试剂盒可为基于one-tube rpa-crispr/cas12a技术检测腺病毒的试剂盒：所述试剂盒可包括rpa扩增试剂和crispr/cas12a检测试剂，其中rpa扩增试剂可包括本发明所述引物对(如引物ade-f1和引物ade-r4)；crispr/cas12a检测试剂可包括所述ssdna、cas12a蛋白和seq id no.12所示的crrna。

17、进一步地，所述试剂盒还可包括携带腺病毒检测靶标基因(seq id no.1)的重组载体(作为阳性参考质粒)。

18、所述携带腺病毒检测靶标基因(seq id no.1)的重组载体具体可为重组载体puc57-ade，所述puc57-ade是将核苷酸序列是序列表中seq id no.1的dna片段克隆到puc57载体中得到的重组载体。

19、进一步地，所述试剂盒还可包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂用于提取来自受试者的生物样品(待测样本)中的核酸。

20、所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。

21、本文所述的crrna和/或探针也在本发明的保护范围内。

22、本发明还提供了所述腺病毒检测靶标基因、所述引物对、所述crrna、所述探针、本文中任一所述的组合物或所述试剂盒在下述任一种应用：

23、a1)在检测腺病毒或制备用于检测腺病毒的产品中的应用；

24、a2)在诊断或辅助诊断腺病毒感染引起的疾病或制备用于诊断或辅助诊断腺病毒感染引起的疾病的产品中的应用；

25、a3)在筛查腺病毒感染引起的疾病或制备用于筛查腺病毒感染引起的疾病的产品中的应用。

26、本文所述产品可为试剂、试剂盒、芯片、试纸或检测卡。

27、所述腺病毒感染引起的疾病包括但不限于呼吸道感染、胃肠道感染、泌尿道感染、结膜感染、脑炎、心肌炎。

28、所述腺病毒包括人腺病毒7个亚群(hadv-a至hadv-g)。

29、本发明还提供了检测腺病毒的方法，所述方法可包括使用所述引物对、本文中任一所述的组合物或所述试剂盒对待测样品进行检测，根据检测结果确定待测样品中是否含有腺病毒或待测样品是否为腺病毒，所述方法的目的为非疾病诊断目的。

30、进一步地，所述方法可包括如下步骤：

31、b1)提取待测样本dna；

32、b2)以所述待测样本dna为模板，利用所述引物对进行rpa扩增，得到rpa扩增产物；

33、b3)对所述rpa扩增产物利用crispr/cas12a检测体系在一管中进行检测；

34、所述crispr/cas12a检测体系包括权利要求7所述的crrna。

35、进一步地，所述引物对由引物ade-f1(seq id no.2)和引物ade-r4(seq id no.9)组成。

36、进一步地，所述rpa扩增的反应体系可包括：冻干的反应微球、rpa上游引物ade-f1、rpa下游引物ade-r4、primer free rehydration buffer、mgoac、模板dna。

37、进一步地，所述rpa扩增的反应体系(40μl)可为：冻干的反应微球1支、rpa上游引物ade-f1(10μm)2.1μl、rpa下游引物ade-r4(10μm)2.1μl、primer free rehydrationbuffer 22.8μl、mgoac(280mm)3μl、模板dna 10μl。

38、进一步地，所述rpa扩增的反应条件可为：39℃，20min(1200s)，记录10min反应荧光值。

39、进一步地，所述crispr/cas12a检测体系可包括：cas12a蛋白、nebuffer、rnaseinhibitor、ssdna和crrna(seq id no.12)。

40、进一步地，所述crispr/cas12a检测体系(10μl)可为：cas12a蛋白(1μm)2.5μl、nebuffer 3.1μl、rnase inhibitor(40u/μl)0.65μl、ssdna(10μm)2.5μl、crrna(seq idno.12)(20μm)1.25μl。

41、进一步地，所述crispr/cas12a检测反应条件为：39℃，反应10min(600s)。

42、在本发明的一个实施方案中，检测腺病毒的方法可为：配制上述rpa扩增反应体系(40μl)，将所有反应液放于反应单元管底。配制crispr/cas12a检测体系，将配置好的crispr/cas12a检测体系放于反应单元的管盖上。将反应单元放入genie ii核酸快速扩增检测系统39℃，扩增20min(1200s)，拿出短暂离心震荡混匀，将管盖的crispr/cas12a检测体系甩到管底与反应完成的rpa扩增产物混合，继续放入genie ii核酸快速扩增检测系统39℃，反应10min(600s)。

43、所述待测样本可包括血液样本(如全血、血浆)、组织样本、唾液样本、环境样本(如土壤、水)等。

44、上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

45、本发明所提供的检测腺病毒的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法如可在细胞水平筛选腺病毒防治药物时检测用药前后细胞内是否含有腺病毒等。

46、本发明首先利用筛选获得了腺病毒保守特异性靶标序列(seq id no.1)，并以此为基础设计相应的引物、探针和crrna，筛选出了理想rpa扩增引物，并建立了基于one-tuberpa-crispr/cas12a的腺病毒检测方法，开发了相关试剂盒。本发明检测腺病毒的方法最低检测限达到100拷贝/ml，具有精准、灵敏、方便、快速的特点，可以快速地检测腺病毒，无需借助昂贵、庞大的仪器以及漫长的反应时间，极大地节约了成本，为腺病毒感染引起的疾病的防控提供了可靠、有效的技术保障，在现场即时检测(poct)领域具有广泛的应用前景。