一种中国被毛孢多糖及其制备方法和应用

本发明涉及多糖提取，尤其涉及一种中国被毛孢多糖及其制备方法和应用。

背景技术：

1、冬虫夏草为传统名贵中药材，是冬虫夏草菌和蝙蝠蛾科昆虫幼虫的复合体。研究表明，冬虫夏草中含有多糖、核苷、蛋白质或多肽、甾醇和d-甘露醇等多种生物活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗菌、抗疲劳和保肾保肝等多种药理功效。作为冬虫夏草的无性型菌株，中国被毛孢(hirsutella sinensis liu,guo,yu et zeng,sp.nov.)具有抗疲劳、抗肿瘤、抗炎、保肾和抑制肺纤维化等多种药理活性，其发酵产物被广泛用于医药和保健食品，其最具代表性的产品为杭州华东医药股份有限公司生产的“百令胶囊”(中国被毛孢cs-c-q80发酵菌丝体)。2010年，中国被毛孢以冬虫夏草(ophiocordyceps sinensis)的无性型菌株被《中华人民共和国药典》(2010版)收录。

2、糖类化合物是自然界中存在最为广泛的，有着重要生物功能的一类化合物，包括单糖及其衍生物、寡糖、多糖和复合多糖等。真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离得到的一类活性多糖。作为一种天然生物大分子，真菌多糖因其广泛的药理活性和低毒副作用的优点，成为生物学和医学领域中的研究热点。冬虫夏草多糖(cordycepspolysacchride，cp)具有免疫调节、降血糖、抗肿瘤等多种药理功效，是冬虫夏草的主要活性成分之一。但是，中国被毛孢多糖的研究却始终未得到广泛关注。

3、多糖，作为中国被毛孢的主要有效成分之一，具有广泛的药理活性，但是，由于多糖结构的复杂性，中国被毛孢中多糖类成分的研究还不够全面深入。

技术实现思路

1、多糖是由多个单糖分子脱水缩合而成的一类结构复杂的糖类物质，结构单位之间以糖苷键相连接，常见的糖苷键有ɑ-1,3糖苷键、β-1,6糖苷键、β-1,4糖苷键、ɑ-1,4糖苷键和β-1,3糖苷键等。多糖广泛存在于动物、植物和微生物中，不同来源的多糖具有不同的生物活性。

2、本发明对中国被毛孢中的多糖进行了提取、分离和纯化，得到了一种新中国被毛孢多糖，经测试，该中国被毛孢多糖能够抑制上皮间质转化(emt)作用，在治疗和/或预防原发性胆汁性胆管炎上具有一定的效果。

3、具体地，本发明提供了一种中国被毛孢多糖组分hswp-1b，由1,4-linked-α-d-glcp残基和4,6-linked-α-d-manp残基组成甘露葡聚糖，1,4-linked-α-d-glcp的o-6位点上分枝，其侧链为1-linked-α-d-glcp。

4、本发明的中国被毛孢多糖组分hswp-1b中除上述结构单元外，还含有以下单糖单元：鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖。

5、其中，所述多糖的平均分子量为5～15kda；

6、进一步地，所述多糖的平均分子量为7～10kda；

7、更进一步地，所述多糖的平均分子量为8.57kda。

8、本发明的中国被毛孢多糖组分hswp-1b红外光谱至少包括下列吸收峰之一或一种以上：3424.33cm-1、2920.28cm-1、2854.17cm-1、1636.73cm-1、1405.36cm-1、1033.51cm-1、851.23cm-1、766.36cm-1、628.62cm-1。

9、其中，3424.33cm-1处的特征的强吸收带反映了糖环上o-h键的拉伸振动；2920.28cm-1、2854.17cm-1的峰能反映糖环上c-h和c-h2边界的拉伸振动；1636.73cm-1处的吸收峰代表c＝o边界的拉伸振动；吡喃糖环的拉伸振动峰为1033.51cm-1，851.23cm-1吸收峰表明存在α构型单糖残基。

10、本发明提供了一种中国被毛孢多糖组分hswp-1c，由1,2,6-linkedα-d-galp、1,3,4.6-linkedα-d-glcp、4,6-linkedβ-d-manp、1,4-linkedα-d-glcp、1,4,6-linkedα-d-glcp和1-linkedα-d-glcp残基组成的半乳甘露葡聚糖。

11、本发明的中国被毛孢多糖组分hswp-1c中除上述结构单元外，还含有以下单糖单元：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸。

12、其中，所述hswp-1c的平均分子量为1～10kda；

13、进一步地，所述hswp-1c的平均分子量为2～6kda；

14、进一步地，所述hswp-1c的平均分子量为2.18kda。

15、本发明的中国被毛孢多糖组分hswp-1c的红外光谱至少包括下列吸收峰之一或一种以上：3432.59cm-1、2926.03cm-1、2845.91cm-1、1639.48cm-1、1599.85、1025.25cm-1、857.23cm-1、620.35cm-1。

16、其中，3432.59cm-1处的特征的强吸收带反映了糖环上o-h键的拉伸振动；2845.91cm-1的峰反映糖环上c-h和c-h2边界的拉伸振动；1639.48cm-1处的吸收峰代表c＝o边界的拉伸振动；吡喃糖环的拉伸振动峰为1025.25cm-1。

17、本发明提供一种中国被毛孢多糖组分hswp-1d，由1,4-linked-α-d-glcp残基和4,6-linked-α-d-manp残基组成甘露葡聚糖，1,4-linked-α-d-glcp的o-6位点上分枝，其侧链为1-linked-α-d-glcp。

18、本发明的中国被毛孢多糖组分hswp-1d还含有以下单糖单元：甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖。

19、其中，所述hswp-1d的平均分子量为1～10kda；

20、进一步地，所述hswp-1d的平均分子量为1～5kda；

21、进一步地，所述hswp-1d的平均分子量为1.09kda。

22、本发明的中国被毛孢多糖组分hswp-1d的红外光谱至少包括下列吸收峰之一或一种以上：3421.58cm-1、2923.03cm-1、2851.42cm-1、1639.48cm-1、1405.36cm-1、1025.25cm-1、851.72cm-1、631.37cm-1。

23、其中，3421.58cm-1处的特征的强吸收带反映了糖环上o-h键的拉伸振动；2923.03cm-1、2851.42cm-1的峰反映糖环上c-h和c-h2边界的拉伸振动；1639.48cm-1处的吸收峰代表c＝o边界的拉伸振动；吡喃糖环的拉伸振动峰为1025.25cm-1。

24、本发明提供了一种中国被毛孢多糖组分的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

25、(1)将多糖提取物通过离子交换柱层析分离，得到多糖组分hswp-1；

26、(2)采用梯度醇沉分离纯化得到多糖组分hswp-1a、hswp-1b、hswp-1c、hswp-1d。

27、步骤(1)所述的多糖提取物是指通过常规方法获取的中国被毛孢粗多糖。本发明所述常规方法包括但不限于水提以及水提后的初步纯化方式。

28、所述水提，包括但不限于加热提取、超声提取、微波提取等常规植物提取物提取方法。

29、所述水提后的初步纯化方式，包括但不限于醇沉、壳聚糖除杂等不同方式。

30、在纯化方法中，还可以根据不同情况，选择性加入除蛋白、脱色、除小分子等辅助手段，便于后续多糖的富集工艺。例如可以使用除蛋白试剂，如酚、三氯乙酸、鞣酸等等；可以使用吸附剂脱色，例如纤维素、硅藻土、活性炭等；可以使用透析等方法除去小分子。

31、在本发明的一些具体实施方案中，所述多糖提取物是指中国被毛孢菌粉经水提、浓缩、醇沉等方式得到的中国被毛孢粗多糖。

32、本发明中，若选用水提醇沉法，则醇沉步骤中，在水提液(或水提液的浓缩液)中加入乙醇，直至乙醇浓度达到70-90％v/v，例如可以选择70％、71％、72％、73％、74％、75％......80％......85％......90％v/v等等。

33、本发明中，步骤(1)中所用离子交换层析柱为阴离子交换层析柱；进一步选自deae纤维素层析柱。

34、进一步地，步骤(2)中的所用醇溶液的浓度为30％～90％；更进一步地，所述醇溶液选自30％、50％、70％、90％。

35、本发明还提供了一种上述多糖组分在制备治疗和/或预防原发性胆汁性胆管炎产品中的应用。

36、进一步地，所述产品为抑制hibec-emt(人肝内胆管上皮细胞-emt)的产品。

37、进一步地，所述产品为增减细胞活率的产品；

38、更进一步地，所述细胞为hibec细胞。

39、原发性胆汁性胆管炎(pbc)，是一种以肝内小胆管破坏和抗线粒体抗体的存在为特征的自身免疫性疾病，最终发展为肝纤维化；肝纤维化的主要特征是毛细血管网络的丧失，纤维胶原蛋白的积累和激活的肌成纤维细胞；而在pbc发生过程中胆管细胞最先受到攻击发生间质化的转变，进而发生肝脏的纤维化，最终导致pbc和肝硬化等疾病的发生。

40、本发明的有益效果如下：本发明从中国被毛孢中提取出四种不同的多糖组分，四种组分能够抑制hibec-emt作用，可以用于治疗和/或治疗原发性胆汁性胆管炎等疾病。

41、缩略词含义

42、hibec：人肝内胆管上皮细胞；

43、pbc：原发性胆汁性胆管炎；

44、emt：上皮间质转化；

45、tgf-β1：转录生长因子；

46、oca：奥贝胆酸；

47、hpgpc：高效液相渗透色谱法；

48、pmp：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮

49、tfa：三氟乙酸

50、ft-ir：傅立叶变换红外光谱

51、1dnmr：一维核磁共振波谱

52、2dnmr：二维核磁共振波谱

53、galp：吡喃半乳糖基

54、gala：半乳糖醛酸

55、gal：半乳糖

56、glc：葡萄糖

57、glca：葡萄糖醛酸

58、kda：千道尔顿

59、man：甘露糖

60、manp：吡喃甘露糖基

61、xyl：木糖

62、nmr：核磁共振波谱

63、bsa：牛血清白蛋。