金黄色葡萄球菌噬菌体vB_SA_STAP152、噬菌体组合物、分子靶标及应用

本发明属于微生物，具体涉及一种金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152、噬菌体组合物、分子靶标及应用。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌是一种兼性厌氧菌，属于革兰氏染色阳性菌，常寄生于人类和动物体上，约30％的人体是该菌的携带者。金黄色葡萄球菌具有一定的致病性，可引起如肺炎、皮肤炎、假肢和伤口部位感染、菌血症等，严重时会危及生命。金黄色葡萄球菌不仅能造成医院和社区感染，同时也是食品行业的重要致病菌，乳制品、速冻食品、生鲜和即食食品常受到金黄色葡萄球菌的污染，可引发食源性疾病。目前，抗生素是治疗金黄色葡萄球菌引起的感染或疾病的主要手段，但近年来，金黄色葡萄球菌耐药性严重，使得该菌的治疗出现效果差、病情反复和并发症等问题。于是，人们开始寻找抗生素的替代品或者补充品，其中噬菌体是重要的候选者之一。

2、噬菌体(bacteriophage)是一类能感染细菌的病毒，主要由核酸(dna或rna)和蛋白质衣壳组成。噬菌体特异性强，只针对特定的目标菌，不会对非目标菌产生影响，不影响生态平衡；另外，噬菌体容易获得、来源丰富，天然的噬菌体来源于污水、人和动物的排泄物等。因此，噬菌体作为生物抑菌剂具有高效安全的优点，在防治金黄色葡萄球菌造成的感染中具有很高的应用价值。在国内外，对于格鲁吉亚地区的人民来说可以在药房就能买到噬菌体鸡尾酒制剂；但对于大多数国家，噬菌体治疗仅限于同情使用。不过，在食品应用上有明显的进步，如美国fda于2006年就批准了用于食品中单增李斯特菌的噬菌体鸡尾酒防控，而由美国intralytix公司研发的针对单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌以及弯曲杆菌的噬菌体鸡尾酒制剂已经应用于食品及食品加工设施中病原菌防控。不过，一些噬菌体存在宿主谱窄、温度和ph稳定性差，或是潜伏期长，爆发量低导致不能高效裂解细菌，从而造成治疗金黄色葡萄球菌效果不佳。2022年，rabia tabassum等人从医院废水分离出金黄色葡萄球菌短尾噬菌体tsp，该噬菌体的潜伏期为20min，平均每个感染细菌的爆发大小为103±5病毒粒子，光密度法结果表明该噬菌体在12h内有效控制金黄色葡萄球菌生长。在cn 116064413 a技术中，金黄色葡萄球菌噬菌体sapyzubeta可有效地感染多种来源的53株金黄色葡萄球菌；在25℃下的牛奶中应中，使用moi为1和0.01的噬菌体处理时，在12h内噬菌体鸡尾酒对细菌的抑制效果无明显作用，当moi为100时，在处理24h后总体细菌减少量为2.8log10 cfu/ml。

3、随着对噬菌体研究工作的深入，对噬菌体的快速识别鉴定、以及对样品中噬菌体定量分析提出了新的要求。基于传统的的培养方法需要用双层平板法进行噬菌斑观察，操作较为繁琐，不利于噬菌体的快速鉴定与识别；随着分子生物技术的发展，以聚合酶链式反应(pcr)为基础的分子检测具有快速、简单、低成本特点，成为主要的检测技术。因此，可以用pcr进行噬菌体鉴定；此外，使用荧光定量pcr检测方法计算样品中菌噬菌体的含量，从而对噬菌体进行定量分析。2023年，maria kornienko等人研究了pcr方法区分烈性葡萄球菌噬菌体herelleviridae科和rountreeviridae科。因此，在使用噬菌体治疗及防控中及时监测特定物种噬菌体很有必要。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供一种对金黄色葡萄球菌具有强裂解力的新型烈性噬菌体vb_sa_stap152，该噬菌体可作为一种抗生素替代品或补充品，应用于防控金黄色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的生物防控中。

2、所述的金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152，命名为staphylococcus aureusphage vb_sa_stap152，于2023年9月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no:63808-b1，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070。

3、所述的金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152分离自广东省广州市某菜市场污水，通过对其特征的鉴定发现该噬菌体对金黄色葡萄球菌尤其是mrsa具有强裂解作用，且裂解谱宽广。

4、进一步地，噬菌体vb_sa_stap152增殖利用宿主菌在lb肉汤培养基、脑心浸出液肉汤(bhi)或牛肉膏蛋白胨培养基进行培养。

5、在本发明的实施方式中，上述噬菌体增殖优选地使用lb肉汤培养基，但不限于上述范围的培养基，能够用于增殖培养噬菌体的物质均可用。

6、在本发明较佳实施方式中，上述金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152具有以下生物学特征：

7、(1)通过透射电镜观察，所述噬菌体vb_sa_stap152头部对称，呈多面体形态，直径约为41nm；尾部长33.4nm、短而不收缩，根据国际病毒分类委员会(ictv)分类标准鉴定该噬菌体为短尾噬菌体。

8、(2)全基因组分析显示，所述噬菌体vb_sa_stap152的基因组为线性双链结构(dsdna)，全基因组长17593bp(genbank登录号为：or573959)，gc含量为29.45％，预测有19个开放阅读框(orfs)；其中19个orfs序列中包括7个编码假设蛋白序列、12个编码已知蛋白功能序列，不存在细菌耐药基因和毒力基因。

9、(3)基于全基因组系统进化树分析及利用nbci数据库比对结果显示，噬菌体vb_sa_stap152与已知金黄色葡萄球菌噬菌体最高的相似性<95％，表明噬菌体vb_sa_stap152为新型金黄色葡萄球菌烈性噬菌体。

10、(4)噬菌体vb_sa_stap152在ph 4-11、25℃-65℃条件下作用1h仍然保持活性，其中在ph 5-9和25℃-45℃维持原有效价基本不变。

11、本发明还提供一种杀灭金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体组合物，所述的组合物含有噬菌体vb_sa_stap152或其他有效成分。

12、本发明还提供一种噬菌体试剂，其包括上述噬菌体vb_sa_stap152或噬菌体vb_sa_stap152组合物。

13、所述的噬菌体试剂包括用于预防或治疗金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起疾病的药物、环境消毒剂或清洁剂、兽用饲料添加剂、食品安全保鲜剂或添加剂。

14、优选地，所述的噬菌体试剂中，噬菌体vb_sa_stap152的有效含量不低于104pfu/ml。

15、优选地，所述的噬菌体试剂可以制备成各种常见剂型，包括水剂、粉剂、悬浮剂或颗粒剂等。

16、进一步地，上述噬菌体试剂中，包含合理必要的载体或助剂，所述的“合理必要”是指不对该噬菌体造成显著损伤或功能降低，而是对噬菌体作用效果发挥以及噬菌体保存、稳定有帮助一些载体或助剂。

17、本发明还提供上述的金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152、噬菌体组合物或噬菌体试剂在杀灭金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。

18、本发明还提供一种杀灭金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：将上述的金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152、噬菌体组合物或噬菌体试剂应用于金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌污染的环境中。

19、本发明还提供上述金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152的特异性分子靶标，该特异性分子靶标的核苷酸序列如seq id no:1所示。

20、本发明还提供一种鉴定金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152的检测引物，包括：正向引物序列：5'-acatgcgtcaagacgaggac-3'，反向引物序列：5'-tgttcaatcacattcccgttct-3'。

21、进一步地，本发明提供一种pcr检测噬菌体vb_sa_stap152的方法，包括以下步骤：提取待检测微生物的dna，以提取的dna为模板采用上述鉴定用的检测引物对其进行pcr扩增，产物大小为761bp。

22、优选地，所述pcr扩增，其反应体系为25μl，其中包括：2×taq master mix 12.5μl、10μmol/l正向引物和反向引物各1μl、dna模板1μl和无菌去离子水9.5μl。

23、优选地，其pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

24、优选地，将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果出现大小761bp的条带，则认为样品中含有或是噬菌体vb_sa_stap152；如未出现目标大小的条带，则不含或非噬菌体vb_sa_stap152。

25、本发明还提供一种用于荧光定量pcr检测金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152的检测引物，包括：正向引物序列：5'-ttgagaacgggaatgtgattga-3'，反向引物序列：5'-ataaaacaccaaatgacacacgta-3'。

26、进一步地，本发明提供一种荧光定量pcr(qpcr)检测噬菌体vb_sa_stap152的方法，包括以下步骤：提取待检测微生物的dna，以提取的dna为模板采用上述荧光定量pcr检测用的检测引物对其进行pcr扩增，产物大小为127bp。

27、优选地，qpcr扩增反应体系为10μl，其中包括：2×sybr green premix预混液5μl，10μmol/l正向引物和反向引物各0.2μl、dna模板1μl和无菌去离子水3.6μl。

28、优选地，qpcr反应条件为：95℃预热5min；两步法扩增95℃5s、64℃退火30s，共进行40个循环。

29、本发明还提供一种试剂盒，其包含上述的鉴定用的检测引物和/或荧光定量pcr检测用的检测引物。

30、本发明从污水中分离到一株烈性噬菌体，经过数据比对，与现有的噬菌体同一性小于95％，认为是新型的金黄色葡萄球菌噬菌体；此外，发现了该噬菌体的特异性分子靶标，如seq id no.1所示的核苷酸序列，与已知的噬菌体序列相似度小于65％。该噬菌体的一步生长曲线显示潜伏期为15min，爆发量为4928pfu/cell，说明该噬菌体能高速繁殖、快速裂解目标细菌；在宿主谱测定中，本发明以218株金黄色葡萄球菌(包括115株mrsa)作为指示菌，进行了更大范围的宿主范围检测；此外，该噬菌体在新鲜猪肉应用中对目标菌有良好抑制效果，无论是moi为0.1还是0.001在噬菌体处理9h后，对宿主菌sta2236-0降低至少4.0log10 cfu/ml，为低moi高效防控金黄色葡萄球菌提供理论和技术支持。

31、本发明具备的有益效果：

32、(1)本发明的金黄色葡萄球菌噬菌体vb_sa_stap152可作为一种有效的金黄色葡萄球菌抑制剂，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，可用于食品、环境中或临床耐药金黄色葡萄球菌的生物防控。

33、(2)本发明的噬菌体vb_sa_stap152在ph 4-11、25℃-65℃条件下作用1h仍然保持活性，其中在ph 5-9和25-45℃维持原有效价未发生明显变化，使不同环境条件下防控金黄色葡萄球菌成为可能。

34、(3)本发明的噬菌体vb_sa_stap152的全基因分析显示其未携带任何毒力或抗生素耐药基因，可安全地运用于金黄色葡萄球菌的防控之中。

35、(4)本发明的噬菌体vb_sa_stap152的宿主谱广，对76％(166/218)金黄色葡萄球菌有效裂解，且对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有良好的裂解能力，能够裂解79％(91/115)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；此外，还能够裂解47％(16/34)的银白色葡萄球菌，但对其他葡萄球菌以及非葡萄球菌不能裂解，为金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林葡萄球菌的噬菌体治疗提供一个新选择。

36、(5)本发明的噬菌体vb_sa_stap152具有特异的分子靶标，可用于实际应用场景中的快速检测，将该噬菌体与其他噬菌体区分。

37、(6)本发明的噬菌体vb_sa_stap152在实际样品应用中具有良好的杀菌作用，说明该噬菌体可用于制备安全有效的抗金黄色葡萄球菌试剂，缓解耐药性金黄色葡萄球菌的问题。

38、金黄色葡萄球菌噬菌体staphylococcus aureus phage vb_sa_stap152于2023年9月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为gdmcc no：63808-b1。