一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法

本发明涉及病虫害防治，更具体的说是涉及一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法。

背景技术：

1、松材线虫病是影响我国森林生态最严重的病害，该病主要由松褐天牛携带松材线虫传播，可危害多种松属植物。该病给森林生态和过敏经济造成了重大损失。松褐天牛是松材线虫病最主要的媒介昆虫，松材线虫病的除治，其根本在于对松褐天牛的除治。

2、松褐天牛是以缺素乏氮营养的木材为食，是寡氮营养型昆虫，而且木头中大多数可用的氮主要以顽固的细胞壁结构糖蛋白形式存在，一些以生物碱的形式存在，仅有0.001％的可用氮以游离氨基酸的形式存在，因此食木昆虫仅靠食物中的氮不能满足日常营养需求，需要从空气中固定n2并转化为氮素才能满足氮营养需求。松褐天牛就具有从空气中固定n2的能力，而且主要是通过肠道中的菌群从空气中固定氮。

3、目前，我国对松材线虫病的控制仍处于十分被动的局面，开辟新的防治途径尤为迫切。通过人工培养、鉴定出松褐天牛肠道中的固氮菌种类，再筛选出有效抑制其肠道固氮菌的药剂，杀死松褐天牛，可以为开辟松褐天牛新的防治技术提供技术支撑，目前，国内外尚未见人工培养、鉴定松褐天牛肠道固氮菌的相关报道。

4、针对上述问题，本发明提供了一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法，为筛选出有效抑制松褐天牛肠道固氮菌的药剂，松褐天牛及松材线虫的防治奠定了基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

2、一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法，包括如下步骤：

3、步骤1)收集虫体原料：于野外不同地点收集松褐天牛幼虫，以松木屑人工饲养，实验前停止喂食12h；

4、步骤2)取虫体肠道：清水洗净天牛幼虫，并用75％乙醇浸泡2-3min，去离子水清洗幼虫表面3次；处理松褐天牛幼虫，沿着松褐天牛幼虫体侧线剪开，将幼虫头部固定，撕开幼虫表皮，剥离脂肪使消化道暴露，取下肠道；

5、步骤3)制备松褐天牛肠液：将幼虫肠道置于研钵中滴入磷酸缓冲液研磨，制成匀浆液；去匀浆液1000μl作为0号匀浆，加入去离子水10倍梯度至10-7，稀释得松褐天牛肠液；

6、步骤4)肠道菌分离与纯化：吸取匀浆液，涂布接种于ashby培养基上，放置于厌氧盒中，再置于人工气候箱中培养1周，待平板上长出菌落后，挑取表征各异的菌落在培养基上划线、纯化、培养，重复上述步骤，直至平板中菌的形态为单菌落，将纯化后的菌落标号；

7、步骤5)菌种生理生化测试：对菌种进行氧化酶活性测试、过氧化氢酶活性测试、苯丙氨酸脱氨酶活性测试、鸟氨酸脱羧酶，赖氨酸脱羧酶，精氨酸双水解酶活性测试、硝酸盐还原试验、吲哚产生试验、m.r试验、v.p试验、明胶液化试验、糖酵解试验、醇类发酵试验、淀粉水解试验等生理生化测试。

8、步骤6)固氮菌菌种鉴定：采用《伯杰细菌鉴定手册(中文第八版)》，按照肠道菌的单菌落形态、革兰氏染色以及生理生化测试结果对松褐天牛肠道固氮菌菌种进行对比鉴定。

9、上述技术方案的有益效果在于：本发明采用《伯杰细菌鉴定手册(中文第八版)》，按照肠道菌的单菌落形态、革兰氏染色以及生理生化测试结果进行比对鉴定，鉴定获得了9种固氮菌。

10、进一步地，步骤1)中，收集松褐天牛幼虫的标准为：体表有光泽，有弹性。

11、上述技术方案的有益效果在于：本发明选择有光泽和弹性个体，以该标准筛选出的松褐天牛幼虫更加健康。

12、进一步地，步骤2)中，所述松褐天牛幼虫处理步骤具体操作为：沿着松褐天牛幼虫体侧线剪开，将幼虫头部用昆虫针刺穿，使其固定在蜡盘上，用尖头镊子从幼虫肛门位置撕开幼虫表皮，并剥离脂肪使消化道暴露，用微量生理盐水冲洗除去黏着在肠道上的脂肪，从虫体的头部和肛门处截断，将完整的肠道取下。

13、上述技术方案的有益效果在于：本发明的技术方案能够获得完整的天牛肠道。

14、进一步地，步骤2)中，分离肠道与脂肪时不可将肠道扯断。

15、进一步地，步骤4)中，所述吸取匀浆液的具体操作为：在超净工作台中用200μl移液器分别吸取浓度为10-1、10-3、10-5、10-7的肠道匀浆各100μl。

16、上述技术方案的有益效果在于：本发明经过培养基培养，发现10-5肠道匀浆中固氮菌生长最好。

17、进一步地，步骤4)中，所述涂布接种肠道匀浆时，每个浓度各涂布2个平板，放置于厌氧盒中，再置于人工气候箱中培养，培养温度为30℃。

18、上述技术方案的有益效果在于：本发明将肠道匀浆涂布平板放置于厌氧盒中，再置于人工气候箱中培养，能培养出固氮菌。

19、一种ashby培养基，该培养基可应用于松褐天牛肠道固氮菌的分离、培养。

20、进一步地，培养基包括如下成分：

21、磷酸氢二钾0.2g、碳酸钙5g、七水合硫酸镁0.2g、葡萄糖10g、氯化钠0.2g、二水合硫酸钙0.1g、琼脂18g、去离子水1000g。

22、进一步地，培养基制备方法如下：

23、将培养基各原料混合，调节ph至7.0±0.2，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，边加热边搅拌，加热时需要不断搅拌防止碳酸钙糊底，灭菌取出培养基之后也要将碳酸钙摇匀；在超净工作台中倒平板，每皿20ml，制得培养基。

24、上述技术方案的有益效果在于：本发明的技术方案能够保证碳酸钙在培养基中的分布均匀，因为碳酸钙容易沉积在容器底部。

25、本发明提供了一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法，取得了分离出了9种可培养的固氮菌，也进行了不同药剂处理下的松褐天牛肠道固氮菌的固氮活性测定，筛选除了1种对松褐天牛固氮活性具有显著影响的药剂，为林间防治松褐天牛开辟了新的途径。

技术特征：

1.一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法，其特征在于：

4.根据权利要求1所述的一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法，其特征在于：

5.根据权利要求1所述的一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法，其特征在于：

6.根据权利要求1所述的一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法，其特征在于：

7.一种ashby培养基，其特征在于，该培养基可应用于如权利要求1-6所述的松褐天牛肠道固氮菌的分离、培养。

8.根据权利要求7所述的一种培养基，其特征在于，包括如下成分：

9.根据权利要求7所述的一种培养基，其特征在于，制备方法如下：

技术总结
本发明属于病虫害防治领域，特别涉及一种松褐天牛肠道固氮菌的分离、鉴定方法。本发明公开了如下步骤：步骤1)收集虫体原料、步骤2)取虫体肠道、步骤3)制备松褐天牛肠液、步骤4)肠道固氮菌分离与纯化、步骤5)菌种生理生化测试、步骤6)固氮菌菌种鉴定。通过本发明公开的方法能够有效分离出松褐天牛肠道中的固氮菌，为筛选出有效抑制松褐天牛肠道固氮菌的药剂，进行松褐天牛及松材线虫的防治提供技术支撑。

技术研发人员：金明霞,邹兵,涂业苟,陶晨辰,万静,严员英,刘晓华,王洋,王文辉
受保护的技术使用者：江西省林业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22