一种利用重组枯草芽孢杆菌生物合成D-塔格糖及其产物分离纯化的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种利用重组枯草芽孢杆菌生物合成d-塔格糖及其产物分离纯化的方法。

背景技术：

1、国际稀有糖协会定义稀有糖为自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。稀有糖因其具有低热减脂、抗氧化、抗肥胖等生理功能引起人们的广泛关注。

2、d-塔格糖(d-半乳糖的差向异构体)是一种低热量稀有糖，甜度是蔗糖的92％，热量为1.5kcal/g，具有预防龋齿和肥胖、降低血糖、对肠道健康有益等生理活性，在食品、饮料、医药和保健等领域具有重要应用潜力。在美国，d-塔格糖已经被食品药品监督管理局(food and drug administration，fda)认定为“一般安全”(generally regarded assafe，gras)成分。2014年，我国国家卫生和计划生育委员会批准d-塔格糖为新食品原料。

3、自然界中的d-塔格糖含量极其微少，难以利用提取法量产。化学合成法虽能够实现d-塔格糖的生产，但是反应过程复杂，容易产生副产物，而且需要有毒有害的化学试剂，对环境不友好，不符合绿色生产的理念，也不适合于食品生产。以酶或全细胞为生物催化剂的生物合成法具有反应条件温和、成本低、生产效率高、产物纯度高等优点，成为d-塔格糖工业化生产的首选方法。然而，相比酶生物合成法，全细胞生物合成法不需要进行细胞破碎、酶的提取、酶的纯化以及酶的固定化等操作，更加高效便捷。而且，全细胞作为生物催化剂更加稳定，对环境变化的抵抗力更强。

4、目前，有关利用重组枯草芽孢杆菌生物合成d-塔格糖及产物分离纯化的生产工艺还未见报道。而建立一种利用重组枯草芽孢杆菌生物合成d-塔格糖及产物分离纯化的完整生产工艺非常迫切。

技术实现思路

1、本发明提供了一种利用重组枯草芽孢杆菌生物合成d-塔格糖及其产物分离纯化的方法。本发明涉及到重组菌的构建、重组菌的培养、生物转化、活性炭脱色、离子交换树脂脱盐、色谱分离和d-塔格糖结晶等7个方面，具有显著的工业化生产食品级d-塔格糖的潜力。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种利用重组枯草芽孢杆菌生物合成d-塔格糖及产物分离纯化的生产工艺，其步骤为：

4、(1)表达l-阿拉伯糖异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建

5、(a)合成l-阿拉伯糖异构酶基因araa；

6、(b)构建重组质粒pma5-araa:

7、将所述l-阿拉伯糖异构酶基因araa连接到载体质粒pma5的限制性酶切位点ndeⅰ和mluⅰ之间，构建得到重组质粒pma5-araa；

8、(c)构建重组枯草芽孢杆菌

9、将重组质粒pma5-araa加入到枯草芽孢杆菌表达感受态细胞bacillus subtiliswb600中，至终浓度为10μg/ml，充分混匀后放入37℃恒温水浴中静置45min；继而放入37℃，200rpm的摇床中培养3h；然后，将菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb固体平板上，37℃静置培养过夜；最后，挑取单菌落转接至lb液体培养基中，并添加卡那霉素至浓度为50μg/ml，37℃，200rpm培养12h，得到重组枯草芽孢杆菌bacillus subtilis wb600-pma5-araa；

10、(2)重组枯草芽孢杆菌的培养

11、将所述重组菌株bacillus subtilis wb600-pma5-araa接种于含有50μg/ml卡那霉素和1mm mn2+的sr液体培养基中，33℃，250rpm培养18h；培养后的菌液10000rpm离心5min收集菌体；

12、(3)利用收集得到的重组枯草芽孢杆菌作为生物催化剂转化d-半乳糖生产d-塔格糖

13、将所述步骤(2)中的菌体用双蒸水洗涤菌体3次，10000rpm离心5min再次收集菌体；用底物溶液重悬菌体至od600为60，构建生物合成d-塔格糖的反应体系，置于70℃恒温水浴锅中反应12-14h，得到含d-塔格糖的反应液；

14、其中，所述底物溶液中同时含有100-500g/l d-半乳糖和20mm tris；所述底物溶液用hcl调整ph至8.0；

15、(4)转化后糖液的脱色处理

16、生物转化反应结束后，将所述步骤(3)中的反应液于10000rpm离心5min去除菌体，取上清液煮沸5min后再重复一次离心，收集得到转化糖液1；按照2％(w/v，g/ml)的比例向转化糖液1中加入活性炭，放入25℃，100rpm摇床中脱色6h；脱色结束后，先利用离心机10000rpm离心10min除去大部分活性炭，然后再利用布氏漏斗，用0.45μm的滤膜进行抽滤操作，得到脱色后澄清的转化糖液2；

17、(5)转化后糖液的脱盐处理

18、将预处理好的阳离子交换树脂a和阴离子交换树脂b分别填充至长40cm、直径为1cm的透明层析柱中，两根层析柱串联使用；将所述步骤(4)中的转化糖液2依次经过阳离子交换树脂床和阴离子交换树脂床，流速为2.5ml/min，清洗用流动相为双蒸水；脱盐处理后的糖液经真空旋转蒸发仪在60℃下浓缩至糖度为35％，命名为转化糖液3；

19、(6)d-半乳糖和d-塔格糖的色谱分离

20、将预处理好的离子交换树脂c利用装柱机在15mpa压力下填充至长1m、直径为0.98cm的带夹套的不锈钢层析柱中，装柱时间为30min，流动相为经过滤超声处理后的双蒸水；设置水浴夹套温度为50℃，温度稳定后，利用注射器注射0.5ml已在50℃水浴中预热的转化糖液3到平衡好的层析柱中，以经过滤超声处理后的双蒸水为流动相，流速为2ml/min进行色谱分离；

21、(7)d-塔格糖的结晶

22、收集经色谱分离得到的d-塔格糖溶液，利用真空旋转蒸发仪在60℃下浓缩至糖度为78％。按照0.1％的比例加入d-塔格糖晶种，放入4℃冰箱中冷却结晶24h；利用离心机在10000rpm和4℃条件下离心5min收集d-塔格糖晶体；然后利用无水乙醇快速清洗d-塔格糖晶体去除表面吸附的糖液，最后将d-塔格糖晶体置于60℃烘箱中干燥3h，得到d-塔格糖粉末。

23、进一步的，所述步骤(1)中l-阿拉伯糖异构酶基因araa具有下列核苷酸序列之一：

24、(1)如seq id no.2所示的核苷酸序列；

25、(2)与seq id no.2所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与seq id no.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。

26、进一步的，所述含mn2+的盐为mncl2、mnso4、mn(no3)或mn(clo4)2。

27、进一步的，所述sr液体培养基的组分为20g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，0.5g/lnacl，2.5mm kcl，10mm mgcl2，20mm葡萄糖。

28、进一步的，所述d-塔格糖溶液的纯度不低于97％；所述d-塔格糖晶体的回收率不低于80％；所述d-塔格糖粉末的纯度不低于99％；所述d-塔格糖的转化率不低于18％。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

30、本发明的方法中所用pma5具有hpaⅱ强启动子，不需要额外添加诱导剂即可表达蛋白，节省成本，而且本发明利用重组枯草芽孢杆菌全细胞生物转化法催化d-半乳糖生产d-塔格糖，细胞催化剂易得，操作简单，反应条件温和，生产效率高且成本低，省时省力；反应液中d-塔格糖的浓度高达233g/l，d-塔格糖的转化率不低于46％；活性炭脱色率达到75.6％；阴阳离子交换树脂脱盐率达到93.8％；色谱分离所得d-塔格糖的回收率为81.6％，d-塔格糖的纯度为97.9％；冷却结晶所得d-塔格糖的回收率为84％，d-塔格糖晶体的纯度为99.9％。本发明不仅提供了一株生产食品级d-塔格糖的重组菌株，而且还提供了生物转化后期转化糖液的一系列纯化、分离、结晶等操作方法，基本满足工业化生产d-塔格糖的要求，可为其它稀有糖的工业化生产提供借鉴。