一种牙髓间充质干细胞微载体支架复合物及其制备方法和应用与流程

本技术涉及细胞工程，尤其是涉及一种牙髓间充质干细胞微载体支架复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、间充质干细胞来源于多种组织(如骨髓组织、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等)，是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞。间充质干细胞可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。间充质干细胞临床应用于解决多种难治性疾病，如在心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。

2、牙髓间充质干细胞存在于牙髓腔内，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。牙髓间充质干细胞相比其他间充质干细胞类型，有着更强的克隆扩增能力和抗炎能力。而且牙髓间充质干细胞来源丰富，取材方便，相比其他干细胞来源的组织有着天然的优势。随着生物技术的发展，牙髓间充质干细胞在治疗各种疾病模型中的研究越来越多，具有广泛的前景。

3、急性肝功能衰竭是指在原来无肝脏基础性疾病而短时间内发生大量肝细胞坏死及严重肝功能损害，并引起肝性脑病的一组严重临床综合征。其临床特点是以往无慢性肝病史，骤然起病，迅速出现黄疸、肝功能衰竭、出血和神经精神症状等。短期内可合并多器官功能障碍综合征。本病病死率高，属于危重病症之一，目前无特效治疗方法。生物人工肝是目前最寄予希望的治疗急性肝衰竭的方法。

4、目前生物人工肝的细胞多为肝脏细胞、肝癌细胞等，抗炎能力有限；肝脏细胞来源受限，扩增能力也有限；肝癌细胞几乎没有抗炎能力，而且因为是癌细胞来源，临床风险较大；目前的细胞扩增方法基本是2d贴壁培养，不便于未来临床治疗和产业化发展，且相比3d培养的细胞细胞活性和生物学功能差；而常规3d培养的细胞需要消化为单细胞冻存和临床应用，单细胞冻存复苏后活率和活性相比冻存前下降较大，影响了治疗效果。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种牙髓间充质干细胞微载体支架复合物及其制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一方面，本技术提供了一种牙髓间充质干细胞微载体支架复合物的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、将牙髓间充质干细胞与微载体进行接种3d培养；

5、s2、在3d悬浮装置中通入含有浓度为1％-5％o2的混合气体，将牙髓间充质干细胞与微载体在渗透压为310mm～345mm的干细胞无血清培养基中连续培养，获得牙髓间充质干细胞微载体支架复合物，冻存。

6、在本技术的技术方案中，将牙髓间充质干细胞接种在微载体上，通过低氧和高渗透压条件进行3d扩增，扩增结束后通过取样计数后，将牙髓间充质干细胞和微载体的细胞支架复合物冻存。本技术获得的牙髓间充质干细胞微载体支架复合物可以分泌较高的细胞因子，发挥更好的抗炎和免疫调节作用；并且，本技术的牙髓间充质干细胞微载体支架复合物可以直接冻存，无需降解支架和制备成单细胞，操作简单，细胞冻存复苏后活性和活率更高，提升了治疗效果。

7、本发明使用微载体进行大规模3d扩增，一方面满足未来临床治疗和产业化发展的要求，操作方便，省时省力，减少污染风险，另一方面3d培养的细胞活性和生物学功能都优于2d培养的细胞。

8、作为本技术所述牙髓间充质干细胞微载体支架复合物的制备方法的优选实施方式，所述牙髓间充质干细胞包括乳牙牙髓间充质干细胞、恒牙牙髓间充质干细胞和未完全发育牙根尖干细胞中的至少一种。优选为乳牙牙髓间充质干细胞。

9、本技术使用牙髓间充质干细胞，其扩增能力、抗炎能力和免疫调节能力都优于其他干细胞类型。

10、作为本技术所述牙髓间充质干细胞微载体支架复合物的制备方法的优选实施方式，所述牙髓间充质干细胞的传代密度为1×104细胞～5×104细胞；在培养体系中，所述牙髓间充质干细胞的用量为：2.5×104细胞/ml～5×104细胞/ml。

11、作为本技术所述牙髓间充质干细胞微载体支架复合物的制备方法的优选实施方式，所述混合气体为体积浓度为94％的n2、体积浓度为5％co2和体积浓度为1％o2的混合气体。

12、当牙髓间充质干细胞和微载体在上述体积浓度的混合气体条件联合高渗透压条件扩增时，可以分泌更高的细胞因子，发挥更好的抗炎和免疫调节作用。牙髓间充质干细胞微载体支架复合物可以直接冻存，无需降解支架和制备成单细胞，操作简单，细胞冻存复苏后活性和活率更高，且上述体积浓度的混合气体条件有利于维持扩增的饱和湿度。

13、作为本技术所述牙髓间充质干细胞微载体支架复合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤s2中，所述干细胞无血清培养基包括以下浓度的组分：

14、无血清基础培养基，终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血小板裂解物，终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素c，终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子，终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子，终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的l-谷氨酰胺，终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子tgf-β1，终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子，终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子；

15、所述干细胞无血清培养基还包括终浓度为1.18wt％～1.29wt％的氯化钾。

16、本技术的干细胞无血清培养基的渗透压通过终浓度为1.18wt％～1.29wt％的氯化钾进行调节，使得本技术的干细胞无血清培养基的渗透压为310mm～345mm，提高了渗透压，进而促进了干细胞的分化和分泌。

17、作为本技术所述牙髓间充质干细胞微载体支架复合物的制备方法的优选实施方式，所述微载体包括三维多孔的明胶，明胶的孔隙率>70％，粒径大小为50～500μm，均一度≤100μm。

18、本技术采用微载体明胶成分主要是便于消化和降解，孔隙率太小会影响扩增效率，细胞也不方便接种进去；粒径太大或太小都会对悬浮培养以及降解有影响；本技术采用上述粒径的明胶，可以较好地提高扩增效率，且不会对悬浮培养以及降解有影响。

19、在一些具体实施例中，所述培养的温度为37℃。

20、在一些具体实施例中，冻存采用细胞冻存液，所述细胞冻存液为含有5％dmso～10％dmso的冻存液，可是商品化的冻存液。

21、本技术的牙髓间充质干细胞微载体支架复合物可以更高密度的冻存，降低了冻存液的用量，降低了dmso进入体内的含量，临床应用更安全。

22、在一些具体实施例中，细胞冻存密度为1×107细胞/ml～5×107细胞/ml。

23、第二方面，本技术提供了上述制备方法获得的牙髓间充质干细胞微载体支架复合物。

24、第三方面，本技术提供了上述牙髓间充质干细胞微载体支架复合物在制备治疗肝衰竭疾病产品中的应用。

25、在一些具体实施例中，所述肝衰竭包括急性肝衰竭或者慢性肝衰竭，优选为急性肝衰竭。

26、作为本技术所述应用的优选实施方式，所述牙髓间充质干细胞微载体支架复合物和辅料混合，灌注于生物反应器中，进行细胞治疗。

27、在一些具体实施例中，所述应用还包括对牙髓间充质干细胞微载体支架复合物进行复苏，复苏条件为水浴，复苏稳定为37℃-42℃，复苏时间为2min-4min。

28、在一些具体实施例中，治疗的方式为生物型人工肝或组合型人工肝治疗。

29、作为本技术所述应用的优选实施方式，所述辅料为生理盐水和5％人白蛋白的混合物，或者所述辅料为复方电解质和5％人白蛋白的混合物，或者所述辅料为乳酸林格式液和5％人白蛋白的混合物。

30、本技术在细胞治疗前，直接解冻牙髓间充质干细胞微载体支架复合物并加入辅料，放入生物人工肝反应器中进行治疗急性肝衰竭。

31、本技术培养体系采用低氧和高渗透压环境，生产的干细胞其抗炎和免疫调节能力都优于普通培养条件；本技术制备的牙髓间充质干细胞微载体支架复合物可以直接冻存，无需消化为单细胞再冻存，冻存后复苏的细胞活率也要优于单细胞冻存条件；复苏后的牙髓间充质干细胞微载体支架复合物可以直接加入人工肝系统的生物反应器中进行治疗，操作方便。

32、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

33、本技术提供一种牙髓间充质干细胞微载体支架复合物及其制备方法和应用，本技术将牙髓间充质干细胞接种在微载体上，通过低氧和高渗透压条件进行3d扩增，扩增结束后通过取样计数后，将牙髓间充质干细胞微载体支架复合物直接进行干细胞液氮冻存。本技术明制备的牙髓间充质干细胞和微载体的细胞支架复合物可以分泌更高的细胞因子，发挥更好的抗炎和免疫调节作用；本技术的牙髓间充质干细胞微载体支架复合物可以直接冻存，无需降解支架和制备成单细胞，操作简单，细胞冻存复苏后活性和活率更高；并且，本技术的牙髓间充质干细胞微载体支架复合物可以更高密度的冻存，降低了冻存液的用量，降低了dmso进入体内的含量，临床应用更安全。细胞治疗前，直接解冻牙髓间充质干细胞微载体支架复合物并加入辅料，放入生物人工肝反应器中进行治疗急性肝衰竭。