一种改性核桃谷蛋白的制备方法

本发明涉及蛋白改性领域，尤其涉及一种改性核桃谷蛋白的制备方法。

背景技术：

1、核桃(juglans regial.)是核桃科核桃属植物，含有多种对人体健康有益的活性成分，具有很高的营养价值和经济价值。中国核桃种植面积广，产量居世界第一。主要用于食品原料、食用油和蛋糕制作的辅料。核桃分离蛋白(wnpi)是核桃油提取过程中的副产物，其含量可达整个核桃粕的50％，有研究表明，核桃分离蛋白人体消化率可达87％，此外，与fao/who推荐的必需氨基酸标准相比，核桃蛋白中必需氨基酸含量达到成人推荐值，是一种优质植物蛋白。然而核桃蛋白中不溶性谷蛋白约占70％，存在胶凝性差、乳化性差、起泡性差等诸多缺点，限制了其在食药领域的应用，大都用做动物饲料或直接丢弃，不仅造成蛋白资源的浪费且污染环境。因此有必要对核桃谷蛋白进行改性，以提高其性能，使其成为食品中的功能成分。

2、蛋白质的理化特性与结构密切相关，因此一般采用物理、化学或酶法等，通过改变蛋白质结构来达到特定产品所需的品质特性。蛋白质的物理改性通常是利用高压、热处理、电场或磁场等方式，改变蛋白质的高级结构和分子间的聚集方式，一般不涉及蛋白质的一级结构的改变，但由于设备昂贵，维修成本高而难以普及。酶法改性是通过蛋白酶的限制性酶解或酶促交联使蛋白质的氨基酸残基和多肽链发生变化，从而达到调控蛋白质功能特理化性的目的，但反应条件较为苛刻且通常会产生令人不愉快的风味物质。化学改性通常是通过化学试剂作用于蛋白质，引入新的基团或者消除蛋白质结构中的已有基团，从而达到改变蛋白质功能特性的目的。化学改性因其具有效果显著、反应简单、应用范围广等特点，逐渐成为现代食品加工领域热点的研究方向之一。

3、在众多化学改性方法中，糖基化被认为是简单、安全、高效的修饰方法，被广泛用于增强蛋白质的功能特性。糖基化改性是希夫碱化合物的amadori重排下，糖类的还原羰基端与蛋白质的游离氨基端相互联结的一种反应，研究显示，多糖修饰下蛋白质的理化特性可实现有效改善。公开号为cn114317660a的中国专利申请公开了一种提高核桃粕蛋白利用率的方法，将获得mw＞30kda的核桃蛋白多肽与麦芽糊精进行糖基化反应；使用截留膜在蒸馏水中透析，除去未反应的糖，冻干制得糖基化核桃肽。糖基化改性后的核桃肽对核桃油的包裹能力显著高于未糖基化之前的核桃肽，在理化特性方面，乳化性、乳化稳定性、吸水/油性及表面疏水性均得到改善。但是该方法对核桃谷蛋白的糖基化程度较低，理化性能改善不明显，故本技术旨在为提高核桃谷蛋白的理化特性提供一种新而有效的改性办法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种改性核桃谷蛋白的制备方法，本发明将琥珀酰化与糖基化联用，实现对蛋白的高阶修饰，进一步提高核桃谷蛋白的水化、表面活性和流变特性。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种改性核桃谷蛋白的制备方法，其特征在于，所述改性方法包括酰基化反应和糖基化反应，具体操作如下：

3、酰基化反应：配制核桃谷蛋白溶液，调节ph至8.8-9.2后，加入琥珀酸酐后搅拌反应，反应结束用hcl溶液调节ph至中性后终止反应，所得酰化蛋白溶液经透析除去残余的琥珀酸酐后，冷冻干燥即获得酰化核桃谷蛋白(glu-sa)；

4、糖基化反应：将海藻酸钠(alg)溶液缓慢滴定到酰化核桃谷蛋白(glu-sa)溶液中，酰化核桃谷蛋白(glu-sa)在反应体系中的最终浓度为1.8-3％(w/v)，海藻酸钠(alg)的最终浓度为0.20％-0.80％(w/v)，室温下搅拌反应，使用盐酸或氢氧化钠溶液将ph调整到中性，继续搅拌反应，形成glu-sa-alg复合溶液；最后将glu-sa-alg复合溶液离心，所得上清液经冷冻干燥处理后即得glu-sa-alg改性谷蛋白复合物。

5、作为优选，所述核桃谷蛋白的制备方法如下：脱脂核桃粕粉与去离子水按1:12-18(w/v)的比例分散，室温搅拌1-3h；悬浮液于3500-4000rpm，20-40min，3-6℃下离心，收集上清液作为清蛋白提取液，后用0.8-1.2m nacl按1:12-18的比例提取沉淀1-4h，在3500-4000rpm，20-40min，3-6℃条件下离心，将上清液作为球蛋白提取液；沉淀中加65-75％乙醇按1:12-18的比例提取沉淀1-3h，在3500-4000rpm，20-40min，3-6℃条件下离心将上清液作为醇溶蛋白提取液；离心后的沉淀用0.08-0.12m naoh按1:12-18的比例搅拌提取1-3h，离心后的上清液为谷蛋白提取液，每步提取重复两次，以利于蛋白组分的充分提取，在3-6℃下透析谷蛋白提取液40-60h后冷冻干燥得到核桃谷蛋白干粉，置于3-6℃冷藏备用。

6、作为优选，所述酰基化反应中将核桃谷蛋白分散于去离子水中，制备质量浓度为15-25mg/ml(1.5-2.5％)的核桃谷蛋白溶液，3-5℃搅拌过夜，用0.8-1.2mol/l naoh调节溶液ph为9.0±0.1，分批加入18-25％的琥珀酸酐(以核桃谷蛋白质量计)，反应过程中不断搅拌，维持反应体系的温度为35-45℃，ph值为9.0±0.1；体系反应3-5h后，用0.8-1.2mol/lhcl溶液调节至中性终止反应，所得酰化蛋白溶液经3-5℃分子量3000-4000da的透析袋透析40-50h除去残余的琥珀酸酐后，冷冻干燥即获得酰化核桃谷蛋白(glu-sa)。

7、作为优选，所述糖基化反应详细过程如下：分别配制3-5％酰化核桃谷蛋白(glu-sa)溶液和0.40％～1.60％海藻酸钠(alg)溶液，搅拌使之完全溶解，为保证充分水化，将两种原液放入冰箱冷藏过夜后，将海藻酸钠(alg)溶液缓慢滴定到glu-sa溶液中，反应体系中glu-sa的最终浓度为1.5-2.5％(w/v)，alg的最终浓度分别为0.20％-0.60％(w/v)；在室温下搅拌2～4h，使用0.8-1.5m盐酸或氢氧化钠溶液将ph调整到中性，搅拌1-2h，形成glu-sa-alg复合溶液，最后将glu-sa-alg复合溶液在3000-4000rpm条件下离心15-25min，所得上清液经冷冻干燥处理后即得glu-sa-alg复合物。

8、本发明的特点如下：本发明首先用琥珀酸酐(sa)对核桃谷蛋白进行琥珀酰化改性，在此基础上采用不同浓度(0～0.8％)海藻酸钠(alg)对琥珀酰化核桃谷蛋白进行糖基化联合改性，研究发现不同浓度(0～0.8％)海藻酸钠(alg)对琥珀酰化核桃谷蛋白(glu-sa)复合物理化性质及结构性质的影响，并探讨其潜在的作用机制。结果表明，海藻酸钠(alg)促进了glu-sa蛋白的展开及交联，形成了稳定的三维网络结构，显著提高了琥珀酰化核桃谷蛋白的热稳定性、粘性、持水持油、乳化及起泡性。然而海藻酸钠的添加量优选限制在0.6％以内，因为过多的海藻酸钠会使蛋白质结构解离成碎片状，进而影响其理化性质。sds-page结果表明，sa与alg通过共价相互作用与glu相连，导致分子量增加，ftir和荧光光谱结果表明，海藻酸钠影响了glu-sa的二级和三级结构，促进了芳香族氨基酸向蛋白质表面的运动和β-折叠的转换。此外，海藻酸钠降低了glu-sa的表面疏水性，增加了游离巯基的含量。微观结构分析表明，经0.6％海藻酸钠处理后，gl u-sa复合物表面均匀规整，胶凝性好。通过分析海藻酸钠处理对glu-sa理化及结构性质的影响，为核桃谷蛋白改性奠定了理论基础，为其开发利用提供了良好的技术参考。

9、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明将琥珀酰化与糖基化连用，实现对谷蛋白的高阶修饰，酰化改性及适度海藻酸钠处理会使蛋白质结构展开，表面更加光滑；适当浓度的海藻酸钠处理会促进琥珀酰化谷蛋白的结构转变。蛋白质结构从α-螺旋和无规卷曲向β-折叠和β-转角转变，α-螺旋/β-折叠数值降低，蛋白质分子的柔韧性增加。与单一琥珀酰化相比，糖基化蛋白的分子量增加，这是亲水糖酐链共价结合的结果。改性处理会促进疏水氨基链的暴露和增加羟基的表面结合，有助于增加蛋白质分子之间的疏水键和氢键相互作用。以上这些结构特征改善了复合物的功能特性，包括增强的持水性、持油性、热稳定性、乳化和泡沫稳定性。复合物的这些性质可用于开发酸性蛋白饮料，用作具有增强性能的乳剂，可用于食品中的递送系统。