一种新的重组胶原蛋白、其制备方法及用途与流程

本发明属于生物化工领域，涉及一种新型的基因工程重组胶原蛋白、其制备方法及用途。

背景技术：

1、胶原蛋白是一种生物高分子蛋白，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％。与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系，是生物科技产业最关键的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业中均有广泛应用。

2、目前工业化使用的胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取动物的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，其主要来源为动物结缔组织，但从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险，同时大规模的制备对供给侧的动物饲养造成巨大的压力。

3、随着基因工程技术的大规模应用，基因工程重组表达胶原利用模式化表达宿主以外源蛋白表达的形式成功地解决了胶原蛋白大规模制备的瓶颈。与传统的动物胶原提取相比，基因工程重组制备胶原具备：1.生产的胶原种类繁多，可以是常见的牛、猪、鱼等来源的胶原蛋白，同样可以生产人源的胶原蛋白，在医疗器械等领域上具有更好的安全性及免疫优效性。2.可以有效的避免动物源疾病，重组胶原通常以简单的原核或者真核细胞为表达宿主，其细胞致病源由于与人的细胞结构差别巨大，不能相互传播。3.生产周期短，节约成本，可以快速放大，适于工业化大规模生产。与动物培养长动辄3-5个月相比，微生物培养周期仅需2、3天且培养简单，提供简单的c源、n源就能进行大规模培养，易于工业级的制备。因此重组胶原特别是重组人源胶原的制备是目前胶原生产研究的热点。

4、重组人胶原由于其氨基酸组成与人体的氨基酸组成相似或一致，因此被认为最接近人体天然合成的胶原蛋白，具有生物相容性好、安全性高同时又具有动物胶原所具有的功效功能，已有大量的文献报道，且已成功开发出商业的产品应用于美容、化妆品及医疗器械领域。

5、目前重组胶原在生产中主要存在以下问题：1)易降解，由于现有的表达体系下重组胶原不能像天然胶原那样形成稳定的三螺旋结构，易被生产体系中的蛋白酶降解；2)难纯化，胶原易降解导致制备的重组胶原纯化过程中除了宿主蛋白干扰之外还需要去除大量的降解蛋白，增加了纯化的难度，使得高纯度的目的蛋白制备变得困难；3)产量低，因为降解问题的存在，使得重组胶原蛋白的产量偏低，，远未达到人们的预期。因此量产的重组胶原种类偏少，严重制约了重组胶原的进一步应用。

6、范代娣等出版的《胶原蛋白材料》公开了一种如序列seq id no.2所示的氨基酸序列的重组胶原蛋白，并命名为cf2715，该蛋白是将iii型胶原天然序列中的27个氨基酸(gergapgfrgpagpngipgekgpager)重复15次形成的重组胶原蛋白，在功效上表现出了极好的促粘附及促增殖的效果，在医美领域具有巨大的潜力。然而，采用微生物宿主表达制备时，该蛋白易被蛋白酶水解导致目标蛋白的产量低，纯化成本过大。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种生物活性与上述cf2715相近、可采用商业化表达宿主在常规条件进行发酵、且分泌产量相比于上述cf2715有明显提高的新的重组胶原蛋白、其制备方法及应用。

2、本发明提供一种新的重组胶原蛋白，其氨基酸序列由来源于人iii型α1链氨基酸功能区的27个氨基酸(gergapgfrgpagpngipgekgpager)重复30次组成，将其命名为cf2730(或2730)。

3、对于通过短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白，由于其氨基酸组成及分布单调，通常认为重复次数越多，分子量越大，重组胶原蛋白的表面电荷负载越大，越不容易达到稳定的平衡状态，因而更易降解。

4、但是，所述cf2730相比于cf2715，重复单元相同，重复次数由15次增加至30次，理论分子量增大一倍，而其目标蛋白发酵产量却明显提高，达到27g/l左右，解决了cf2715产业化的瓶颈。

5、发明人针对cf2730的上述反常现象进行了研究，研究结果表明：cf2730在空间上形成了鸟巢式结构，这可能有利于其平衡表面电荷和/或亲疏水性，从而使得分子整体上更稳定，不易降解。虽然cf2730的翻译量不及cf2715，但其不易降解，分泌至表达宿主细胞外的完整蛋白占胞外蛋白的90％以上，因此分泌产量相比于上述cf2715有明显提高。

6、本发明包括：

7、1.一种iii型重组胶原蛋白，其由来自天然人iii型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，其中，所述短氨基酸序列如seq id no.:1(gergapgfrgpagpngipgekgpager)所示，重复次数为30次。

8、2.根据项1所述的iii型重组胶原蛋白，其还带有使其易于纯化的标签。

9、3.根据项2所述的iii型重组胶原蛋白，其中，所述标签为his标签、flag标签或c-myc标签。

10、4.编码项1～3中任一项所述的iii型重组胶原蛋白的核酸。

11、5.包含项4所述的核酸的表达载体。

12、6.导入了项5所述的表达载体的宿主细胞。

13、7.一种项1～3所述的iii型重组胶原蛋白的生产方法，其包括培养项6所述的宿主细胞，使其分泌所述iii型重组胶原蛋白至培养基中，并对所述培养基中的蛋白进行分离纯化，从而得到所述iii型重组胶原蛋白。

14、8.根据项7所述的生产方法，其中，所述分离纯化采用盐析、色谱层析、亲和层析、酸碱沉淀、膜分离等方法中的一种或几种的组合，优选色谱层析与膜分离的组合，更优选离子交换层析与膜分离的组合。

15、9.根据项1～3所述的iii型重组胶原蛋白在护肤品、保健品、组织工程材料、医疗器械等中用途，优选在组织工程材料、医疗器械中的用途。

16、10.根据项9所述的用途，其中，所述组织工程材料选自皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、血管支架、细胞间质支架和胶原蛋白海绵。

17、本发明的有益效果在于：提供了一种新的氨基酸组成的的iii型重组胶原，该重组胶原由来源于人iii型α1链氨基酸功能区的27个氨基酸反复重复组成，相比已报到的cf2715，其氨基酸组成由27个氨基酸重复15次提高到了30次，分子量翻倍，但是新的的iii型重组胶原有效的解决了cf2715降解及产量的问题，发酵产物sds-page电泳结果呈现一条带，未见明显的降解条带，目标蛋白占胞外蛋白的90％以上，易于分离纯化，产量明显提升，达到25g/l左右，同时本重组胶原易于分离纯化，通过简单的膜分离及层析分离即可制备纯度达97％以上的纯品，工艺易于放大。在功能方面本发明提供的重组胶原保留了cf2715胶原蛋白在组织修复、促粘附等方面的功能，更易于用于组织材料及医疗器械中。

技术特征：

1.一种iii型重组胶原蛋白，其由来自天然人iii型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，其中，所述短氨基酸序列如seq id no.:1(gergapgfrgpagpngipgekgpager)所示，重复次数为30次。

2.根据权利要求1所述的iii型重组胶原蛋白，其还带有使其易于纯化的标签。

3.根据权利要求2所述的iii型重组胶原蛋白，其中，所述标签为his标签、flag标签或c-myc标签。

4.编码权利要求1～3中任一项所述的iii型重组胶原蛋白的核酸。

5.包含权利要求4所述的核酸的表达载体。

6.导入了权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。

7.一种权利要求1～3所述的iii型重组胶原蛋白的生产方法，其包括培养权利要求6所述的宿主细胞，使其分泌所述iii型重组胶原蛋白至培养基中，并对所述培养基中的蛋白进行分离纯化，从而得到所述iii型重组胶原蛋白。

8.根据权利要求7所述的生产方法，其中，所述分离纯化采用盐析、色谱层析、亲和层析、酸碱沉淀、膜分离等方法中的一种或几种的组合，优选色谱层析与膜分离的组合，更优选离子交换层析与膜分离的组合。

9.根据权利要求1～3中任一项所述的iii型重组胶原蛋白在护肤品、保健品、组织工程材料、医疗器械等中用途，优选在组织工程材料、医疗器械中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述组织工程材料选自皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、血管支架、细胞间质支架和胶原蛋白海绵。

技术总结
本发明涉及一种新的重组胶原蛋白、其制备方法及用途。本发明的III型重组胶原蛋白由来自天然人III型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，其中，所述短氨基酸序列如SEQ ID No.:1(GERGAPGFRGPAGP NGIPGEKGPAGER)所示，重复次数为30次。本发明的III型重组胶原蛋白可采用商业化表达宿主在常规条件进行发酵、且分泌产量高。

技术研发人员：范代娣,董维亮,宇文伟刚,宋养斌,刘琳,段志广
受保护的技术使用者：陕西巨子生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1