一种红色荧光报告蛋白、质粒及其应用的制作方法

本发明涉及蛋白质工程，特别涉及一种红色荧光报告蛋白、质粒及其应用。

背景技术：

1、1999年，matz等从珊瑚虫中分离出了能在紫外照射下发出红色荧光的蛋白质—红色荧光蛋白(rfp)。rfp基因编码的蛋白质由200多个氨基酸组成，与gfp一样，rfp在二级结构上同样形成了β桶状的结构，其结构基础对发光影响重大。rfp发射波长为560～610nm。相比于gfp，它有更高的荧光强度，成像背景低，并能激发和发射更长的波长。因为共轭结构是rfp荧光蛋白发色的关键，因此在rfp氨基酸内部插入一段氨基酸序列很可能引起rfp激发荧光的破坏。

2、许多病毒在复制增殖过程中，均需要有蛋白酶的帮助。一些病毒的蛋白酶具有自裂解功能可以将其多聚蛋白前体裂解到有功能活性的蛋白，抑制这些蛋白酶活性就可以阻碍病毒的复制增殖。例如：人类免疫缺陷病毒(hiv，human immunodeficiency virus)蛋白酶能够将hiv的gag基因和gag-pol基因表达的多聚蛋白裂解成病毒需要的蛋白。hiv蛋白酶在hiv病毒的成熟与复制过程中起到非常关键的作用，抑制该酶会产生无感染力的子代病毒，从而阻止病毒进一步感染；又如，新冠病毒的多聚蛋白由两种病毒蛋白酶进行裂解，木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro，papain-like protease)和3c样蛋白(3clpro，3-chymotrypsinlike protease)，它们分别负责3个位点和11个位点的蛋白裂解。其中3clpro由于它的切割特异性很强，可避免脱靶的可能，被广泛认为可作为优秀的药物靶点。

3、然而，目前靶点为蛋白酶的抗病毒药物开发，早期的候选药物筛选主要是将蛋白酶表达出来，在非细胞水平对候选药物进行筛选和评价。这种方式漏筛和误筛的概率都十分高，这是因为抗病毒药物在动物体内作用方式主要是需要进入活体细胞对靶蛋白产生抑制，而这种方式缺失了候选药物进入活细胞的过程，因而不能评价或筛选药物的真实活性水平，因此开发一种简洁、安全、高通量和可重复性的蛋白酶活性以及相关蛋白酶抑制剂活性筛选平台十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种红色荧光报告蛋白、质粒及其应用，通过在野生型红色荧光蛋白内部的特定位置插入能被蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列，而不影响红色荧光蛋白的发光功能，从而形成一种全新的红色荧光报告蛋白，当插入的外源氨基酸序列被识别并裂解后，直接破坏了红色荧光蛋白的结构，导致荧光淬灭，基于这种现象，可以进行多种应用，比如对蛋白酶活性的评价，对蛋白酶抑制剂效果的评价、抗病毒药物的筛选等。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种红色荧光报告蛋白，通过改造红色荧光蛋白而成，具体为：在红色荧光蛋白的特定位置插入能被蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列，插入的外源氨基酸序列不影响红色荧光蛋白的发光功能；

4、所述特定位置包括插入区域；

5、插入区域选自第一插入区域、第二插入区域、第三插入区域、第四插入区域中的一种，

6、第一插入区域的氨基酸序列为padggl，

7、第二插入区域的氨基酸序列为kkpaknlkmpgv，

8、第三插入区域的氨基酸序列为rikead，

9、第四插入区域的氨基酸序列为varycdlps。

10、红色荧光蛋白的氨基酸序列为seq id no.1所示氨基酸序列或与seq id no.1所示氨基酸序列相比具有95％以上序列一致性的氨基酸序列。

11、一种红色荧光报告蛋白，通过改造红色荧光蛋白而成，具体为：在红色荧光蛋白的特定位置插入能被蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列，插入的外源氨基酸序列不影响红色荧光蛋白的发光功能；

12、所述特定位置包括单独的插入位点；

13、单独的插入位点包括独立位点a、独立位点b，

14、独立位点a为rfp氨基酸序列的第145-146位氨基酸，或与rfp氨基酸序列相比具有95％以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；

15、独立位点b为rfp氨基酸序列的第208-209位氨基酸，或与rfp氨基酸序列相比具有95％以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；

16、所述rfp氨基酸序列见seq id no.1所示。

17、本发明经过研究，意外的发现，在红色荧光蛋白内的某些特定位置(4个区域和两个单独的插入点)插入特定长度的氨基酸序列后，红色荧光蛋白仍能维持原有发光功能，本发明的这种改造的荧光插入位点在红色荧光蛋白序列内部，当插入序列受到破坏时，红色荧光蛋白的结构同时被破坏，导致荧光淬灭。这样的发现能够给红色荧光蛋白带来全新的应用，比如与病毒成熟与复制相关的蛋白酶，该类蛋白酶可以作为抗病毒药物的靶点，那么通过本发明的红色荧光报告蛋白则可以为筛选全新的抗病毒药物服务，当蛋白酶正常发挥功能时红色荧光蛋白被切割成两部分丧失功能，此时荧光消失；当蛋白酶被抑制时红色荧光蛋白能够正常发出荧光，根据红色荧光蛋白的荧光强度还能正向反映蛋白酶抑制剂的抑制效果。这一系列操作均可以在细胞水平进行，可以完全模拟候选药物在细胞内发挥作用的全过程，而现有的抗病毒药物筛选方法由于是在非细胞水平进行操作，缺失了候选药物进入细胞的过程，很容易造成候选药物的漏筛和误筛，且需要体外表达蛋白酶，耗时耗力，本发明的红色荧光报告蛋白应用后则能完全克服现有方法的缺点，可以简便、高通量的进行蛋白酶抑制剂类抗病毒候选药物筛选。

18、插入的外源氨基酸序列的长度小于等于16个氨基酸。优选的，插入的外源氨基酸序列的长度小于等于10个氨基酸。

19、所述外源氨基酸序列包括能被病毒蛋白酶切割的蛋白酶切割序列。

20、所述病毒蛋白酶来自所有正链rna病毒，部分负链rna病毒和部分dna病毒中的一种，具体包括小核糖核酸病毒科病毒、杯状病毒科病毒、披膜病毒科病毒、黄病毒科病毒、肠病毒科、逆转录病毒科病毒、冠状病毒科病毒、疱疹病毒科、痘病毒科病毒中的一种。优选地，所述病毒蛋白酶来自新型冠状病毒蛋白酶(如3clpro)、艾滋病病毒蛋白酶(如protease)、手足口病病毒蛋白酶(如3c)、登革热病毒蛋白酶(如ns2b-ns3)、单纯疱疹病毒蛋白酶(如ul26)、丙型肝炎病毒蛋白酶(如ns3/4a)中的一种。

21、能被病毒蛋白酶切割的蛋白酶切割序列选择seq id no.2-seq id no.12所示序列中的一种或多种的组合。

22、第一插入区域、第二插入区域、第三插入区域以及第四插入区域内的任意两个氨基酸之间构成插入位点。

23、一种核苷酸，其编码所述的红色荧光报告蛋白。

24、一种质粒，其包括所述的红色荧光报告蛋白的编码核苷酸序列。

25、进一步地，所述质粒还包括病毒蛋白酶的编码核苷酸序，所述质粒共表达红色荧光报告蛋白和病毒蛋白酶。

26、一种以蛋白酶为靶点的抗病毒药物筛选方法，包括以下步骤：

27、(1)构建共表达所述的红色荧光报告蛋白和病毒蛋白酶的共表达质粒；

28、(2)筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加待筛选药物，以不添加待筛选药物组为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选药物对病毒蛋白酶具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选药物对病毒蛋白酶的抑制效果越强。

29、一种蛋白酶抑制剂的正向可视化抑制效果评价方法，包括以下步骤：

30、(1)构建共表达所述的红色荧光报告蛋白和病毒蛋白酶的共表达质粒；

31、(2)评价：将待转染细胞铺于细胞培养皿中，然后加入共表达质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向细胞培养皿中添加抑制剂，以不添加抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；荧光强度正向反映抑制剂的抑制效果，荧光强度越高则代表抑制剂对病毒蛋白酶的抑制效果越强。

32、本发明的有益效果是：

33、1、本发明通过在野生型红色荧光蛋白内部的特定位置插入能被蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列，而不影响红色荧光蛋白的发光功能，从而形成一种全新的红色荧光报告蛋白，当插入的外源氨基酸序列被识别并裂解后，直接破坏了红色荧光蛋白的结构，导致荧光淬灭。

34、2、本发明基于改造的红色荧光，可以蛋白酶为靶点进行抗病毒药物筛选，抗病毒药物对蛋白酶的抑制效果与荧光强度呈正相关，可以非常便捷、直观的定性判断抑制效果，同时进一步通过测定荧光值，可定量分析抑制效果。

35、3、本发明抗病毒药物筛选方法和蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，通过观察细胞的荧光信号即可获得定性结果，能够避免使用活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，bsl-1级实验室即可满足实验要求，具有高效、准确、稳定、高通量、可重复的优点。