一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法及其应用

本发明涉及菌种共培养，特别是涉及一种棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55的固态发酵方法及其应用。

背景技术：

1、烟草疫霉(phytophthora nicotianae)是引起烟草黑胫病主要的病原菌，对烟草种植造成巨大的危害。目前，烟草黑胫病的防治依然是以农药为主的化学防治。但是，化学防治也导致了抗药性、农药残留和环境污染等问题，因此，开发对环境更加友好的生物防治方法和产品具有重要意义。生防微生物通过产生抑菌物质、与病原菌竞争营养和空间、寄生在病原菌内或使植物产生诱抗作用来发挥防病和抗病作用，具有无毒害、无残留、安全环保等优点，成为烟草病害生物防治的重要方法和手段。

2、木霉和芽孢杆菌作为应用最为广泛、效果最为显著的生防菌，对多种植物病原菌具有明显的抑制作用。然而，单一菌种的生防效果不稳定，采用不同生防菌株进行共培养发酵，可以提高优势菌株生存及生防效果的潜力。

3、目前的共培养菌剂的发酵主要为液态发酵，但液体发酵共培养过程中两株菌的菌量和代谢产物产量未达到预期效果。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55的固态发酵方法及其应用。本发明提供的固态发酵方法有效的提高了共培养后两株生防菌的菌量；并进行了盆栽实验，获得了显著的防治效果。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种棘孢木霉(trichoderma asperellum)hg1与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tpb55的固态发酵方法，包括：

4、将枯草芽孢杆菌tpb55种子液接种到大米培养基中，静置培养12～14h后，接种棘孢木霉hg1种子液，继续静置培养，得到共培养混合物；所述棘孢木霉hg1种子液与枯草芽孢杆菌tpb55种子液的接种体积比为2：1；所述棘孢木霉hg1种子液的孢子浓度为≥1×106cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌tpb55种子液的孢子浓度为≥1×106cfu/ml。

5、优选的，所述静置培养的温度为25～28℃。

6、优选的，所述枯草芽孢杆菌tpb55种子液和大米培养基的体积质量比为3ml：100g。

7、优选的，继续静置培养的时间为14～30d。

8、优选的，所述大米培养基包括大米和水。

9、优选的，所述大米培养基中大米和水的质量体积比为8～9g：11ml。

10、优选的，所述大米培养基的制备方法包括：将大米和水混合后，高温灭菌，得到所述大米培养基。

11、优选的，所述高温灭菌包括：121℃灭菌20min或115℃或30min。

12、本发明还提供了一种生防制剂，所述生防制剂的制备方法包括：利用上述技术方案所述固态发酵方法制备得到共培养混合物；利用乙酸乙酯将所述共培养混合物洗脱，得到洗脱液为所述生防菌剂。

13、本发明还提供了利用上述技术方案所述固态发酵方法制备得到共培养混合物或上述技术方案所述的生防制剂在防治烟草疫霉和/或促进植物生长中的应用。

14、有益效果：

15、本发明提供了一种棘孢木霉(trichoderma asperellum)hg1与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tpb55的固态发酵方法，包括：将枯草芽孢杆菌tpb55种子液接种到大米培养基中，静置培养12～14h后，接种棘孢木霉hg1种子液，继续静置培养，得到共培养混合物；所述棘孢木霉hg1种子液与枯草芽孢杆菌tpb55种子液的接种体积比为2：1；所述棘孢木霉hg1种子液的孢子浓度为≥1×106cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌tpb55种子液的孢子浓度为≥1×106cfu/ml。本发明通过适宜的接种比例和培养顺序，将棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55在大米培养基中进行共培养，采用固态发酵方法对棘孢木霉hg1和枯草芽孢杆菌tpb55进行共培养，使木霉能够在固体培养基表面和内部产孢，提高孢子产量，从而能够更好刺激微生物持续发酵，有效的提高共培养后两株生防菌的菌量；并进行了盆栽实验，获得了显著的防治效果。

技术特征：

1.一种棘孢木霉(trichoderma asperellum)hg1与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tpb55的固态发酵方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的固态发酵方法，其特征在于，所述静置培养的温度为25～28℃。

3.根据权利要求1所述的固态发酵方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌tpb55种子液和大米培养基的体积质量比为3ml：100g。

4.根据权利要求1所述的固态发酵方法，其特征在于，继续静置培养的时间为14～30d。

5.根据权利要求1所述的固态发酵方法，其特征在于，所述大米培养基包括大米和水。

6.根据权利要求5所述的固态发酵方法，其特征在于，所述大米培养基中大米和水的质量体积比为8～9g：11ml。

7.根据权利要求5或6所述的固态发酵方法，其特征在于，所述大米培养基的制备方法包括：将大米和水混合后，高温灭菌，得到所述大米培养基。

8.根据权利要求7所述的固态发酵方法，其特征在于，所述高温灭菌包括：121℃灭菌20min或115℃或30min。

9.一种生防制剂，其特征在于，所述生防制剂的制备方法包括：利用权利要求1～8任一项所述固态发酵方法制备得到共培养混合物；利用乙酸乙酯将所述共培养混合物洗脱，得到洗脱液为所述生防菌剂。

10.利用权利要求1～8任一项所述固态发酵方法制备得到共培养混合物或权利要求9所述的生防制剂在防治烟草疫霉和/或促进植物生长中的应用。

技术总结
本发明涉及菌种共培养技术领域，特别是涉及一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法及其应用。本发明通过适宜的接种比例和培养顺序，将棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55在大米培养基中进行共培养，采用固态发酵方法对棘孢木霉HG1和枯草芽孢杆菌tpb55进行共培养，使木霉能够在固体培养基表面和内部产孢，提高孢子产量，从而能够更好刺激微生物持续发酵，有效的提高共培养后两株生防菌的菌量；并进行了盆栽实验，获得了显著的防治效果。

技术研发人员：赵栋霖,张成省,李义强,彭治鑫,李清钰,王美,郑艳芬,徐康文
受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8