一种基于切刻酶扩增与CRISPR/Cas12b结合的一体化核酸检测方法

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种基于切刻酶辅助扩增技术与crispr结合的一体化核酸检测方法。

背景技术：

1、聚合酶链式反应(pcr)通过从一个特定dna片段的单个副本中产生数百万个dna序列副本，是实验室核酸检测的金标准。其主要原理是在热稳定dna聚合酶的作用下，利用温度循环实现引物识别和延伸，完成特定dna片段的体外扩增。仅需少量dna，在经过循环指数扩增后就可达到可检测水平，这为分析人员的定量和定性分析提供了便利条件。但精确控制温度循环需要精密的设备，这导致该方法只能集中在实验室中进行。

2、近年来兴起的等温扩增技术填补了pcr技术的局限性，环介导等温扩增技术(lamp)是利用嗜热脂肪芽孢杆菌(bst)dna聚合酶在60至65℃的等温条件下实现核酸大量复制的体外扩增反应，其可以在约30min实现目标核酸的检测。重组酶聚合酶扩增技术(rpa)是另外一种极具潜力的恒温扩增方法，rpa使用两个引物于37～42℃的恒定温度下在20～40分钟内实现目标序列的指数扩增。常温反应、简单的程序和短的扩增时间使得rpa成为核酸检测的有力技术。滚环扩增(rca)是一种作用于环状dna分子的等温扩增反应。rca利用具有链置换活性的phi 29噬菌体dna聚合酶来延伸与环状dna模板退火的单个或多个引物。聚合酶的链置换活性允许新合成的dna模板置换先前产生的dna分子从而释放ssdna，rca反应大多数是在37～40℃下约40分钟完成。

3、切刻酶辅助扩增技术(near)是通过dna聚合酶和切刻酶的协同作用实现的核酸扩增方法。相对于其他恒温扩增方法，near具有极高的扩增效率，扩增产物可以在很短的时间内(～10分钟)以指数级积累108倍以上。与普通引物不同，用于near反应的引物是专门设计的，其包括一个5’端随机序列区、切刻酶识别区(例如，5’-gagtcnnnn-3’，nt.bstnbi)和与靶核酸链互补的靶结合区。在near过程中，聚合酶一次又一次地从缺口中延伸链，下游的靶序列被置换，切口酶不断地在双链dna产物中产生缺口，这种重复的切刻、延伸和置换的循环使得靶标dna得到指数式增长。但对于某些核酸目标，dna双链的呼吸作用与聚合酶的强链置换活性不足以打开双链，引物难以嵌入到模版中导致特异性扩增失败，因此在靶片段上必须存在切刻酶的识别序列(例如，5’-gagtcnnnn-3’，nt.bstnbi)。然后根据所选择的片段进行引物设计，同时还应考虑tm值、二级结构和引物二聚体、扩增片段大小等因素，因此需要综合考虑以确定某一特定靶标是否可用于near反应。此外与lamp和rpa相比，near在反应中产生了大量的非特异性产物，这些副产物不仅严重抑制了正向反应的进展，而且极大地限制了检测灵敏度水平，极大的限制了near的应用。

4、为推广near的应用，将near与其他分析方法结合使用，已经开发出具有各种信号输出工具的核酸传感器，如荧光、比色和电化学信号。near可以用cdte量子点作为荧光标记，分子信标可用作near反应的报告器，与其他放大方法结合开发超低检测限双扩增检测方法。此外，near反应也可用于传统可视化方法(如比色法)、经典的电化学dna传感器系统的核酸检测。但特异性效果仍然有限，因此需要开发更为精确地序列特异性分析方法。

5、近年来crispr/cas技术迅速发展，掀起了分子生物学领域的新变革，其高特异性、灵活、易于模块化分析的特点受到广泛关注，也逐渐被应用至扩增产物分析，成为新型的信号元件。crispr/cas体系主要通过cas效应蛋白与向导rna的相互作用调动体系的反应机制。所有cas效应蛋白都依赖crrna来引导对靶标双链dna、单链dna或单链rna底物的互补链的识别与结合，以实现顺式裂解活性。此外某些ii类cas蛋白如cas12a，cas12b，cas13a等具备反式切割活性，可以在cas效应蛋白顺式切割活性激活的同时，激活其反式切割活性，任意切割蛋白存在环境中的单链dna或单链rna，这一现象已被应用于核酸快速检测中。但其灵敏度有限，提高crispr/cas核酸分析灵敏度的一种手段是将靶标扩增，当与等温扩增技术结合时将大大提高扩增产物检测的序列特异性，有望提高检测的特异性和灵敏度，同时实现现场可视化分析。

6、然而，当将crispr/cas技术与等温扩增技术结合时，可能会出现一系列问题导致检测失败。第一，crispr/cas技术与等温扩增技术反应成分不兼容，同时调节体系中的多个反应组分更可能导致检测失败。第二，由于cas效应蛋白强烈的顺式与反式切割活性，会出现靶标和引物被cas效应蛋白过度消耗致使扩增失败，从而使检测失败。在此过程中，不得不开盖的两步式操作还带来了气溶胶污染问题。因此，针对目前的现有技术中存在的开盖污染、复杂的序列设计、繁琐的操作步骤、较长的反应时间、反应体系不兼容等问题，亟需开发一种更准确、简便、无污染的可视化扩增产物分析手段。

技术实现思路

1、crispr/cas体系的高度特异性靶标识别机制，为扩增条件苛刻的near体系提供了更优的产物分析途径。其中如何解决两个体系的不兼容性，near扩增效率与crispr/cas体系的切割效率差异是实现一体化的关键突破步骤，具有一定的挑战性。因此，本发明的目的是开发出一种基于切刻酶扩增与crispr/cas12b结合的一体化核酸检测方法，该方法反应效率高，并且可以在不打开反应容器的情况下进行检测过程和结果判定。

2、针对现有技术的不足，在第一方面，本发明提供了一种核酸检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

3、(1)针对待检测目标dna设计含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对，所述内引物对对应的上游内引物和下游内引物按5’至3’顺序包含三个部分：引物5’端为约11～13nt的随机序列区，紧接是切刻酶识别区gagtcnnnn，其后是约13～18nt的模板特异性识别区，所述模板特异性识别区选取在目标dna序列中cas12b识别位点两侧；所述外引物对的上游外引物是位于距所述上游内引物的上游3nt的16～20nt的序列，所述外引物对的下游外引物是位于距所述下游内引物的下游3nt的16～20nt的序列；

4、(2)提取待测样品的基因组dna；

5、(3)在所述基因组dna中一次性加入所述内引物对和外引物对、dntps、缓冲液、切刻酶、bst dna聚合酶、靶向目标dna的sgrna、cas12b蛋白、荧光标记的单链dna报告子，以进行扩增切割一体化反应；

6、(4)根据荧光标记的单链dna报告子类型对反应产物进行光照激发，从而判断所述目标dna是否存在。

7、在第二方面，本发明提供了一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：针对待检测目标dna设计的含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对、dntps、缓冲液、切刻酶、bstdna聚合酶、cas12b蛋白、靶向目标dna的sgrna、荧光标记的单链dna报告子；

8、其中所述内引物对对应的上游内引物和下游内引物按5’至3’顺序包含三个部分：引物5’端为约11～13nt的随机序列区，紧接是切刻酶识别区gagtcnnnn，其后是约13～18nt的模板特异性识别区，所述模板特异性识别区选取在目标dna序列中cas12b识别位点两侧；所述外引物对的上游外引物是位于距所述上游内引物的上游3nt的16～20nt的序列，所述外引物对的下游外引物是位于距所述下游内引物的下游3nt的16～20nt的序列；

9、任选地，所述试剂盒还包括rnase抑制剂。

10、在第三方面，本发明提供了根据本发明的第一方面或第二方面所述的方法或试剂盒的用途，其特征在于，其用于核酸检测。

11、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

12、本发明将核酸扩增和cas12b切割检测集成在一个反应体系中，可以一次性添加所有反应组分而无需打开再次反应容器就可以实现对检测结果的裸眼观测，大大降低了气溶胶污染问题；

13、该反应操作简便，恒温反应，无需温度循环，可以实现序列特异性的现场可视化分析；

14、本发明反应时间短，最快可实现5min检测，灵敏度高，设计灵活，适用于多种对象与多元化场景。