一种高产己二胺基因工程菌株及其构建方法与运用

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种高产己二胺基因工程菌株及其构建方法与运用。

背景技术：

0、现有技术

1、近年来，日益增加的全球环境、气候变化和化石燃料来源等问题正在导致传统大宗化学品的生产向更绿色、可再生、经济和可持续的路线转变。细胞工厂的出现及应用大大缓解了这一难题，可利用廉价原料持续高效生产高附加值产品。而体内碳链延长则是一种有巨大潜力的途径，可以用来合成不同链长的同类酸类、醇类物质，这些都是具有重要研究价值的生物燃料和材料的重要组成物质。

2、尼龙作为一种合成纤维，是最常见的聚酰胺材料之一，其材料单体为己二胺(hexamethylenediamine)，据现有报道，己二胺主要通过以己二腈法制备，而己二腈原料依赖进口，因此有成本偏高和供给不便的因素存在，己二胺的合成在当前仍存在低产量、高能耗和环境污染等亟待解决的问题。而l-赖氨酸作为一种重要的商品氨基酸，在全球范围内具有百万吨级的生产能力，在过去的几十年里，合成生物学与生物化学的组合已成熟运用于低成本原料高效稳定生产生物化学产品，可以通过以l-赖氨酸为底物，以基因工程改造重组大肠杆菌为载体，实现高效可控地生产己二胺产品，对建立高效持续可控的生物化工产业具有重要意义。在生物法合成己二胺的案例中，已公开专利cn113755419a描述了一种通过双菌株联合发酵生产己二胺的办法，但实验操作步骤繁琐、批次产物产量较低。因此，本专利拟通过筛选组合催化用酶，反复对比同工或异源酶对己二胺合成整体催化的影响，对微生物中α-酮酸、亮氨酸等合成路径进行定向进化，得到一种更适合用于己二胺合成的路径和方法。

3、对三十余种转氨酶和二十余种脱羧酶进行筛选，最终选择了一组优势组合方式，将生产己二胺关键基因进行整合，使改造后的工程菌株拥有独立生产己二胺的能力，实现l-赖氨酸“一锅法”合成聚酰胺类材料单体己二胺，并获得其它具有高价值的中间产物，实现生物基材料生产的新突破。

技术实现思路

1、本发明针对上述问题，提供一种高产己二胺的基因工程菌株和两种辅助合成己二胺的重组质粒，提供高产己二胺基因工程菌株和两种辅助合成己二胺重组质粒的构建方法，提供一种基因工程菌株和两种重组质粒在体外催化、全细胞催化和菌株发酵生产己二胺过程中的方法。

2、经本发明人研究，确定的技术思路为：l-赖氨酸氧化酶lysox催化l-赖氨酸脱氨基合成α-酮基-ε-氨基己酸，经过leua基因、leub基因、leuc基因和leud基因的催化，完成碳链的延伸，经过vfl基因、kdca基因、ddc基因、dat基因完成系列转氨脱羧反应，最终形成目标产物己二胺，同时形成其它具高附加值的化学品，并具备可调控性。

3、本发明提供一种能辅助生产己二胺的重组质粒或质粒组合，其是将lysox基因、2-苹果酸异丙酯合酶leua基因、3-异丙基苹果酸脱氢酶leub基因、3-异丙基苹果酸脱水酶基因leuc和3-异丙基苹果酸脱水酶leud基因；以及芳香族-l-氨基酸脱羧酶ddc基因、丙酮酸转氨酶vfl基因、丙氨酸转氨酶dat基因和支链α-酮酸脱羧酶kdca基因构建在一个重组质粒上，或者分别构建在两个或三个或四个或五个或六个或七个或八个或九个重组质粒上形成质粒组合；

4、优选地，2-苹果酸异丙酯合酶基因、3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、3-异丙基苹果酸脱水酶基因和3-异丙基苹果酸脱水酶基因来源于大肠杆菌；所述ddc基因来源于小鼠(musmusculus)。

5、优选地，lysox基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，leua基因的核苷酸序列如seq id no:2所示，leub基因的核苷酸序列如seq id no:3所示，leuc基因的核苷酸序列如seq id no:4所示，leud基因的核苷酸序列如seq id no:5所示；所述vfl基因的核苷酸序列如seq id no:9所示，所述dat基因的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述kdca基因的核苷酸序列如seq id no:6所示

6、另外优选地，将lysox基因、2-苹果酸异丙酯合酶leua基因、3-异丙基苹果酸脱氢酶leub基因、3-异丙基苹果酸脱水酶基因leuc和3-异丙基苹果酸脱水酶leud基因构建在一个质粒上，称为第一重组质粒，优选地其出发质粒pet28a；而将芳香族-l-氨基酸脱羧酶ddc基因、丙酮酸转氨酶vfl基因、丙氨酸转氨酶dat基因和支链α-酮酸脱羧酶kdca基因构建在另一个重组质粒上，称为第二重组质粒，优选地其出发质粒pet21a。

7、具体优选地，将各基因通过无缝克隆技术连接构建到出发质粒上获得第一重组质粒和第二重组质粒，优选地，第一重组质粒的核苷酸序列如seq id no:10所示，第二重组质粒的核苷酸序列如seq id no:11所示。

8、本发明提供一种能以l-赖氨酸生产己二胺的基因工程菌株，所述基因工程菌株中同时导入lysox基因、2-苹果酸异丙酯合酶leua基因、3-异丙基苹果酸脱氢酶leub基因、3-异丙基苹果酸脱水酶基因leuc和3-异丙基苹果酸脱水酶leud基因，以及芳香族-l-氨基酸脱羧酶ddc基因、丙酮酸转氨酶vfl基因、丙氨酸转氨酶dat基因和支链α-酮酸脱羧酶kdca基因共9种基因；

9、优选地，2-苹果酸异丙酯合酶基因、3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、3-异丙基苹果酸脱水酶基因和3-异丙基苹果酸脱水酶基因来源于大肠杆菌、所述ddc基因来源于小鼠(musmusculus)；

10、更优选地，lysox基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，leua基因的核苷酸序列如seq id no:2所示，leub基因的核苷酸序列如seq id no:3所示，leuc基因的核苷酸序列如seq id no:4所示，leud基因的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述ddc基因的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述vfl基因的核苷酸序列如seq id no:9所示，所述dat基因的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述kdca基因的核苷酸序列如seq id no:6所示。

11、在具体实施方式中，所述9种基因同时构建在一个表达质粒上，或者分别构建在两个表达质粒，三个表达质粒，四个表达质粒，五个表达质粒，六个表达质粒，七个表达质粒，八个表达质粒或九个表达质粒上，导入出发菌株得到生产己二胺的基因工程菌株；

12、更具体地，通过导入如权利要求1至4任一项所述的质粒或质粒组合到出发菌株中得到生产己二胺的基因工程菌株。

13、在具体实施方式中，所述基因工程菌株的出发菌是原核细菌，例如大肠杆菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌等。

14、本发明提供一种使用所述的基因工程菌株生产己二胺的方法，其利用所述基因工程菌株以l-赖氨酸为底物发酵得到己二胺；任选地，还包括分离或纯化得到的己二胺的步骤。

15、优选地，所述发酵方法如下：

16、培养基为lb液体培养基，培养基用氢氧化钠溶液调节ph值在6.8～7.5之间，在发酵过程中，控制溶氧在30～35％，发酵温度为32℃，初始转速设置为300rpm，后转为转速偶联溶氧，当葡萄糖出现明显下降趋势后开始补糖，使葡萄糖浓度维持在5.5～7.5g/l。

17、更具体地，发酵过程中，l-赖氨酸、胺供体丙氨酸、胺供体谷氨酰胺和葡萄糖的投入总量分别如下：

18、(1)l-赖氨酸投入总量：10g～120g，底物l-赖氨酸补料时间分别为：16h～21h、34h～39h、52h～57h；

19、(2)胺供体丙氨酸投入总量：5g-75g，胺供体丙氨酸补料时间分别为：16h～21h、34h～39h、52h～57h；

20、(3)胺供体谷氨酰胺投入总量：5g-75g，胺供体谷氨酰胺补料时间分别为：16h～21h、34h～39h、52h～57h；

21、(4)葡萄糖投入总量：25g～150g，葡萄糖补料时间分别为：27h～32h、43h～48h、62h～67h。

22、本发明的有益之处在于：通过基因工程技术改造，通过双途径共宿主灵活催化合成己二胺，减弱了单一合成途径中的催化阻力；己二胺合成途径的全基因整合，极大省略了繁琐的实验步骤，减小了能源的消耗；本发明得到的重组菌株可以高产己二胺工程菌株，在一个具体实验，其己二胺产量高达10.58g/l，具有明显的优势。