一种永生化小鼠肠神经细胞系、构建方法及其应用与流程

本发明属于生物医学，尤其涉及一种永生化小鼠肠神经细胞系、构建方法及其应用。

背景技术：

1、肠无神经节细胞症，又称先天性巨结肠(hirschsprung’s disease,hscr)，是一种以消化道远端肠神经节细胞缺乏为特征的肠神经系统发育异常性疾病，由胚胎期肠神经嵴细胞(enteric neural crest cell,encc)迁移、增殖、分化、定植障碍所致。hscr是人类胚胎肠神经系统发育异常性疾病，其发病机制复杂、动物模型构建困难，因此常需要肠神经相关的工具细胞于体外进行研究。然而，目前尚缺乏成熟稳定的肠神经细胞系，大多数文献报道研究hscr仍主要采用来自人神经母细胞瘤的神经相关工具细胞，包括sk-n-be2和sh-sy5y等。此类细胞虽然已有成熟的商品化细胞系，获取与培养较为容易，具有与神经细胞相似的形态、生长状态以及对刺激的反应能力，同时作为人源细胞株对人体疾病的研究也具有一定的参考价值，但此类细胞是神经肿瘤组织来源，尽管其具备一定的神经特性，但并非真正的肠神经细胞，无法准确模拟肠神经发育过程以及hscr的疾病特征，并且难以真实反映肠神经细胞对各种干预处理的实际应答情况。因此，亟需构建新型的具有肠神经细胞特征的工具细胞以提高肠神经发育与hscr发病等相关研究的可信度。

2、相较于普通细胞系，原代细胞可以真实地反映某类细胞在体内的病理生理状态，在胚胎发育、组织维持与重塑、肿瘤发生机制等研究领域已得到广泛的应用。在肠神经系统相关疾病的研究中，由于人类胚胎来源的肠神经细胞获取极为困难且可重复性较低，越来越多的研究选择提取培养小鼠肠神经原代细胞(enteric nervous primary cell,enpc)进行体外实验，以便于更加准确地模拟肠神经形成和发育过程中肠神经细胞的功能改变。但遗憾的是，在肠神经原代细胞的实际应用中，仍然存在着提取步骤复杂、传代次数有限、干预手段较少以及效果欠佳等不足，这极大地限制了肠神经系统相关研究的开展。因此，如何在提高肠神经原代细胞的增殖能力、增加其传代次数的同时保持其肠神经细胞的特性成为亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、为克服相关技术中存在的问题，本发明拟应用猿猴空泡病毒40(simianvacuolating virus 40,sv40)感染小鼠肠神经原代细胞，使其脱离正常衰老死亡过程并获得持续分裂能力，最终构建成具备培养简单、可多次传代、均一性好等优点的永生化小鼠肠神经细胞(immortalized enteric nervous cell,i-enc)。本发明将为hscr等肠神经系统相关疾病的研究提供更为有力的工具细胞，有望提升国内肠神经系统研究平台，并带来新的进展突破。

2、所述技术方案如下：

3、本发明的第一个发明目的在于：提供了一种永生化小鼠肠神经细胞系，其保藏号为cctccno：c2023252，于2023年08月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：永生化小鼠肠神经细胞(immortalized mouse enteric nervous cell,i-enc)。

4、本发明的第二个发明目的在于：提供了一种永生化小鼠肠神经细胞系的构建方法，包括以下步骤：

5、s101：小鼠肠神经原代细胞提取、培养

6、取野生型孕14.5至16.5天c57bl/6j小鼠胚胎，于体视显微镜下分离胚胎小鼠的肠组织，于超净台内完成对肠组织内肠神经原代细胞的分离培养；

7、s102：小鼠肠神经原代细胞鉴定

8、培养小鼠肠神经原代细胞至第7天，4％多聚甲醛固定细胞后，采用免疫荧光实验检测细胞中神经标志物的表达情况；

9、s103：sv40永生化慢病毒感染

10、根据感染复数公式moi＝慢病毒滴度(iu/ml)×加入的病毒体积(ml)/待染的总细胞数，计算转染细胞所用的慢病毒sv40体积后进行慢病毒感染。

11、s104：永生化小鼠肠神经细胞检测和鉴定

12、慢病毒感染成功后对细胞进行连续传代，取第20代细胞(20th i-enc)，提取细胞总rna检测细胞永生化相关基因sv40的表达水平，同时通过免疫荧光法检测细胞中神经标志物(calretinin,pgp9.5)的表达情况；

13、s105：永生化小鼠肠神经细胞鉴定完成后(持续表达永生化相关基因sv40，神经标志蛋白表达阳性，梭形形态、生长状态良好)，即得到永生化小鼠肠神经细胞系。

14、在一个实施例中，步骤s102具体包括以下步骤：

15、s201：培养小鼠肠神经原代细胞至第7天；

16、s202：弃培养基，pbs清洗后加入4％多聚甲醛固定细胞30min；

17、s203：加入0.5％triton x-100透化细胞20min；

18、s204：3％h2o2处理细胞5min后，加入免疫荧光封闭液封闭20min；

19、s205：孵育神经干性标志蛋白nestin以及神经细胞标志物pgpg9.5一抗，4℃过夜；

20、s206：pbs清洗后孵育相应属性的荧光二抗，37℃，60min；

21、s207：pbs清洗后加入dapi染核5min；

22、s208：激光共聚焦显微镜下观察神经标志蛋白表达情况。

23、在一个实施例中，步骤s104中检测细胞永生化相关基因sv40的表达水平的sv40引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示，内参gapdh引物序列如seq id no.3和seq idno.4所示。

24、在一个实施例中，步骤s104中检测细胞中神经标志物的表达情况包括：检测神经前体标志物nestin的表达以及神经细胞标志物calretinin和pgp9.5的表达。

25、在一个实施例中，步骤s104中检测细胞中神经标志物的表达情况，具体包括以下步骤：

26、s401：将永生化肠神经细胞接种于激光共聚焦皿中，培养2天；

27、s402：弃培养基，pbs清洗后加入4％多聚甲醛固定细胞30min；

28、s403：使用0.5％triton x-100透化细胞20min；

29、s404：3％h2o2处理细胞5min，随后使用免疫荧光封闭液封闭20min；

30、s405：分别孵育神经前体标志物nestin以及神经细胞标志物pgpg9.5和calretinin一抗，4℃过夜；

31、s406：pbs清洗后进行对应属性的荧光二抗孵育，37℃，60min；

32、s407：pbs清洗后加入dapi染核5min；

33、s408：激光共聚焦显微镜下观察神经标志蛋白表达分布情况。

34、本发明的第三个发明目的在于：提供了一种永生化小鼠肠神经细胞系在作为临床前研究肠神经系统相关疾病的通用工具细胞模型中的应用。

35、本发明的第四个发明目的在于：提供了一种永生化小鼠肠神经细胞系在作为临床前研究先天性巨结肠的工具细胞模型中的应用。

36、本发明的第五个发明目的在于：提供了一种永生化小鼠肠神经细胞系在治疗先天性巨结肠的药物筛选中的细胞模型的应用。

37、第一、结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：目前在肠神经系统相关的研究中，尚缺乏简易有效的工具细胞模型，本发明应用sv40病毒感染小鼠肠神经原代细胞，使其脱离正常衰老死亡过程并获得持续分裂能力，最终构建成具备培养简单(培养基配制方便、细胞贴壁易于操作、抗干扰能力强)、可多次传代(实现永生化，无需再反复提取原代细胞)、均一性好(细胞状态与形态特征等在不同代数之间稳定保持)等优点的永生化小鼠肠神经细胞(immortalized enteric nervous cell,i-enc)，本发明将为hscr等肠神经系统相关疾病的研究提供更为有力的工具细胞，有望提升国内肠神经系统研究平台，并带来新的进展突破。

38、本发明其优势还在于：本发明构建的永生化小鼠肠神经细胞不仅可以准确模拟肠神经的生长发育过程，并且能够克服肠神经原代细胞提取步骤复杂、增殖不足、培养困难等缺点，有望成为肠神经系统相关疾病研究的通用工具细胞系，提高肠神经系统的研究水平、科学性和可信度。

39、第二、作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

40、1.本发明构建的永生化小鼠肠神经细胞系具有稳定性高、易培养、成本低等优势，具备潜在的成品化价值，通过商业化包装进入市场流通转化后，预计具有巨大的商业价值和预期收益。

41、2.目前，国内外尚缺乏具备培养简单、可多次传代、均一性好等优点的永生化的肠神经细胞系，本发明通过提取小鼠肠神经原代细胞并进行永生化处理，获得了永生化小鼠肠神经细胞，填补了国内外行业内的技术空白。

42、3.截至目前，类似于先天性巨结肠等肠神经系统疾病的基础研究总是受限于工具细胞的选择，一方面是由于包括sk-n-be2、sh-sy5y等常用的工具细胞系并非肠神经系统来源，导致研究结果的可信度不高，另一方面是由于肠神经原代细胞的分离步骤复杂、培养周期较长、进行功能实验的难度较大，无法充分满足各项研究的需求，因此研究者一直渴望解决上述问题，从而获得更为合适的工具细胞。本发明的技术方案即克服了这一技术难题，该细胞系的成功构建不仅解决了非肠神经系统来源的问题，而且具备易于获取、培养周期短以及对所需干预处理的敏感性高等优势，从而满足相关研究的需要，解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题。