一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法

本发明涉及生物，特别涉及一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法。

背景技术：

1、细胞系是用来体外开展生命研究的重要工具，鱼类细胞系由于生长温度范围广，培养方法简单，在许多生物学研究中要优于哺乳动物细胞系或鸟类细胞系。因此，开发鱼类细胞系对鱼类遗传学、病原微生物和环境毒性等方面的研究具有重要意义。

2、鱼鳍细胞具有较强的增殖能力，且取样过程简单，可多次重复取样等特点，是理想的鱼类原代细胞培养材料。鱼类细胞系建立过程中，原代细胞培养最常用的培养方法为组织块培养法和单层细胞培养法（也即酶消化法）。组织块法是将组织块剪成大小约为1 mm×1 mm×1 mm，加入适量的培养基后直接进行培养，细胞会从组织块中溢出，围绕组织块进行生长。单层细胞培养法通过消化酶对组织块进行消化处理，消化酶一般采用dispase ii酶、胶原酶i、中性蛋白酶和胰蛋白酶等处理，然后分离收集游离的细胞，加入适量培养基进行单层培养。目前用于鱼类细胞培养的基础培养基包括l-15（leibowits l-15），mem（modified eagle's medium），dmem（dulbecco's modified eagle medium），dmem/f12，prim-1640和m199（media 199），其中，l-15基础培养基由于富含丰富的氨基酸，不依赖于环境co2浓度，且许多鱼类细胞能在l-15中获得更加的生长性能，备受科研工作者青睐。多数鱼类细胞系的开发以l-15为基础培养基，添加20%胎牛血清（fbs）以及其它生长因子（如egf）来建立可持续的细胞培养物，进而建立细胞系，少数则是通过使用其它基础培养基获得鱼类细胞系。

3、然而，通过以上方法建立的鱼类细胞系大多数为成纤维样（fibroblast-like）细胞系，而获得的类上皮样（epithelial-like）细胞系则很少，且存在一定的随机性，即使在培养条件相同的情况下，多次培养不一定均能获得类上皮样细胞，多数时候以成纤维样细胞为主，不能稳定获得类上皮样细胞系，非常不利于鱼类细胞系特别是类上皮样细胞系的稳定开发和应用。因此，开展鱼类鱼鳍类上皮样细胞培养技术的探索研究，不仅能丰富鱼类细胞系种类，也能为鱼类在细胞学知识及在相关基础理论研究方面提供丰富的体外实验材料。

4、根据现有需要，开发一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法成为亟需解决的问题。

5、现有的鱼类细胞培养方法由于受到培养基成分特别是胎牛血清fbs的限制，在培养鱼类组织细胞时，成纤维样细胞很容易获得优先生长，而类上皮样细胞在传代的过程由于生长缓慢和大量死亡，直接导致后期建立的鱼类细胞系大多为成纤维样细胞，类上皮样细胞系很难建立，而且存在一定的随机性，即使在相同的实验条件下也不能稳定建立类上皮样细胞系。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法，通过在培养基中添加一定浓度的y-27632、a83-01和chir99021，促进鱼鳍中类上皮细胞的生长，抑制其凋亡，从而可以稳定的获得鱼鳍类上皮样细胞系，提高鱼类鱼鳍来源的上皮样细胞系的构建效率。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了组合物，包括rock抑制剂、tgf-β抑制剂和gsk-3抑制剂。

4、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中，所述rock抑制剂、所述tgf-β抑制剂和所述gsk-3抑制剂的摩尔比为a:b:1，其中：

5、a选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40；

6、b选自1、2、3、4、5、6、7、8。

7、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中，所述rock抑制剂、所述tgf-β抑制剂和所述gsk-3抑制剂的摩尔比为10:4:1。

8、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中：

9、所述rock抑制剂包括y-27632或y-27632的衍生物；和/或

10、所述tgf-β抑制剂包括a83-01；和/或

11、所述gsk-3抑制剂包括chir99021。

12、本发明还提供了上述组合物在如下方面中的应用：

13、（i）、培养上皮样细胞；和/或

14、（ii）、制备上皮样细胞培养基；

15、所述上皮样细胞包括鱼鳍上皮样细胞；

16、所述鱼鳍上皮样细胞包括鱼尾鳍上皮样细胞、背鳍上皮样细胞或胸鳍上皮样细胞中的一种、两种或多种。

17、本发明还提供了培养基，包括基质、上述组合物，以及可接受的辅料或助剂。

18、在本发明的一些具体实施方案中，上述培养基中，所述基质包括l-15培养基。

19、在本发明的一些具体实施方案中，上述培养基中，所述rock抑制剂的浓度为1 μm、2 μm、5 μm、10 μm、15 μm；所述tgf-β抑制剂的浓度1 μm、2 μm、4 μm、6 μm；所述gsk-3抑制剂的浓度为0.25 μm、0.5 μm、1 μm、2 μm。

20、本发明还提供了上述培养基在培养上皮样细胞中的应用；

21、所述上皮样细胞包括鱼鳍上皮样细胞；

22、所述鱼鳍上皮样细胞包括鱼尾鳍上皮样细胞、背鳍上皮样细胞或胸鳍上皮样细胞中的一种、两种或多种。

23、本发明还提供了上皮样细胞的培养方法，其基于上述组合物或上述培养基培养；

24、所述上皮样细胞包括鱼鳍上皮样细胞；

25、所述鱼鳍上皮样细胞包括鱼尾鳍上皮样细胞、背鳍上皮样细胞或胸鳍上皮样细胞中的一种、两种或多种。

26、在本发明的一些具体实施方案中，上述培养方法包括如下步骤：

27、步骤（1）：采集鱼鳍组织，清洁灭菌，剪碎，获得碎组织；

28、步骤（2）：取步骤（1）所述碎组织接入含有上述组合物、fbs和抗生素的l-15培养基，培养4～6天，更新培养基，使所述rock抑制剂、所述tgf-β抑制剂和所述gsk-3抑制剂的浓度分别下降一半，培养至第12天时，更新培养基，使所述rock抑制剂、所述tgf-β抑制剂和所述gsk-3抑制剂含量皆为零，培养，传代；

29、所述鱼鳍包括鱼尾鳍、背鳍或胸鳍中的一种、两种或多种；

30、所述fbs在所述l-15培养基中的含量为20%；

31、所述抗生素包括100 u/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素和0.50 mg/ml庆大霉素的混合溶液。

32、本发明的培养方法有如下效果：

33、（1）培养基中添加y-27632，a83-01和chir99021有助于上皮样细胞系的建立，处理时间超过12天，细胞出现严重的空泡化现象（如图1所示）；处理时间在2天时，成纤维样细胞出现严重的凋亡。对未处理组和处理组细胞进行传代，未处理组以成纤维样细胞为主，且传代培养细胞存活率低，处理组以上皮样细胞为主，且细胞数量远多于未处理组（如图2所示），可见，y-27632，a83-01和chir99021的处理有助于上皮样细胞系的建立。

34、（2）经测试，培养基中添加y-27632浓度为5～10 μm，a83-01浓度为1～2 μm，chir99021浓度为0.25～1 μm，均可显著促进细胞的增殖（如图3所示）。