一种原代树鼩主动脉弓平滑肌细胞的分离培养方法

本发明涉及一种原代树鼩主动脉弓平滑肌细胞的分离培养方法，属于生物技术/细胞分离培养。

背景技术：

1、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，vsmcs)是构成血管中膜的主要细胞成分，是机体重要的代谢和内分泌器官之一，在各种各样的生理过程中发挥着重要作用。

2、生理情况下vsmcs表型主要为收缩型，主要特征为细胞内肌丝丰富，收缩功能较强，几乎无分裂增殖能力，主要功能为参与维持主动脉壁的机械性能；当收缩型vsmcs受内外因素刺激时可转化为合成型，主要特征为分裂增殖能力强，合成分泌功能旺盛，肌丝含量少，收缩功能弱，主要功能为参与受损血管壁的修复。

3、vsmcs功能障碍与许多疾病的发生发展密切相关。研究表明，vsmcs通过自身增殖、迁移、自噬、凋亡、钙化、衰老和表型转换等，影响动脉粥样硬化（atherosclerosis，as）的形成及发展；2型糖尿病血管并发症的发生与处于动脉中膜的vsmcs增殖和向内膜的迁移有关；此外，该细胞还参与高血压、移植血管病、血管成形术后再狭窄和血管壁损伤后的修复等多种血管疾病的生理、病理过程。因此，vsmcs已经成为生物医学领域中重要的研究对象。

4、树鼩是一种接近于灵长类的新型实验动物，被广泛应用于人类重大疾病模型的创建和致病机制研究。研究者们先后建立了糖尿病、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝等代谢性疾病的树鼩模型，并对其机制及相关影响因素进行了研究。在此基础上，进行树鼩主动脉vsmcs的分离和培养，对探讨主动脉相关疾病的致病机制和筛选有效的治疗药物具有重要意义和应用价值。

技术实现思路

1、本发明提供了一种原代树鼩主动脉弓平滑肌细胞的分离培养方法，该方法获得的细胞经多次传代可保持旺盛活力和均一的形态，为主动脉疾病相关的研究提供了优质可靠的实验材料。

2、本发明目的通过以下技术方案实现：

3、1、树鼩主动脉弓的分离

4、取1岁左右健康树鼩，腹腔注射3%戊巴比妥钠0.5ml过量麻醉处死，迅速剪开胸腔，暴露心脏部位，使用含1%青霉素-链霉素的生理盐水执行心脏灌注；灌注结束后，从右心耳处向上理出升主动脉，剪取主动脉弓段，转入4℃预冷含1%青霉素-链霉素的生理盐水中备用；

5、树鼩主动脉弓的组织块贴壁培养

6、将步骤1中所取主动脉弓转入培养皿中，用含1%青霉素-链霉素的生理盐水反复冲洗，剪去分支，剔除血管外残留结缔组织，仅保留主动脉弓段；在解剖镜下，纵向剪开主动脉弓，将内膜外翻，使用镊子撕去动脉弓内膜，剪成0.8-1.1mm小块；用镊子将组织块转移至24孔板，每孔仅放置一个组织块，预先加入80-120μl 含10-15% fbs和1%青霉素-链霉素的dmem/f-12培养基，在37℃、5%co2条件下培养1小时后再补加培养基（含10-15% fbs和1%青霉素-链霉素的dmem/f-12培养基）180-220μl；继续培养数日，每隔2天更换新鲜培养基，定期观察细胞生长状况；

7、树鼩主动脉弓平滑肌细胞的传代培养

8、显微镜下定期观察细胞生长状况，通常3天左右可见少量细胞从组织块迁出，7-9天至细胞基本铺满孔底，选择形态均一的细胞进行传代培养；吸弃旧培养基，用含1%青霉素-链霉素的pbs冲洗1次，加入0.25% 胰蛋白酶100μl，消化1min 左右至大部分细胞收缩变圆，加入含10-15%fbs、1%青霉素-链霉素的dmem/f-12培养基终止消化，反复吹打均匀，按1:2的传代比例转入12孔板继续培养；之后按1:2的传代比例依次转入6孔板和t25小方瓶进行扩大培养；

9、4、树鼩主动脉弓平滑肌细胞的免疫荧光鉴定

10、选择生长状态好的细胞，消化传代接种在12孔培养板，待细胞长满培养孔底部时可进行免疫荧光染色：吸弃培养基，用pbs冲洗1次，加入 4%的多聚甲醛固定20min，pbs漂洗孔板3次，每次3min；加入0.5%triton x-100进行细胞穿孔20min，pbs清洗3次，每次3 min；使用5%的山羊血清进行封闭30min，去除山羊血清后pbs漂洗3次，每次3min；加入稀释好的α-sma一抗（1:1000稀释），同时设置vwf和cd31对照孔，将培养板放置于4℃孵育过夜，将培养板用pbs漂洗3，每次3 min；避光条件下进行二抗孵育步骤，在培养孔中加入相对应稀释过的二抗，于37℃孵育60min，pbs漂洗次，每次3 min；在培养孔中加入稀释好的dapi染色液，避光常温条件下孵育2 min，pbs清洗3次，每次3min；在荧光显微镜下观察并拍照，视野下可见细胞整体呈现α-sma阳性，vwf和cd31呈阴性。

11、目前制备大小鼠等实验动物主动脉vsmcs的方法主要有组织块贴壁法和酶消化法，其中前者往往采用多个组织块培养在培养皿或者小方瓶中培养，往往存在较多杂细胞，纯化难度较高，综合耗时较长；后者对酶处理的技巧要求高，细胞得率相对较低，且在内膜剥离不完全的情况下，也易引入较多杂细胞。本发明在取材前执行心脏灌注，最大限度减少血液等成分对原代培养的干扰；在解剖镜下尽量去除主动脉弓内膜，在培养前减少内皮细胞等的污染机率；采用单个组织块植入24孔板进行贴壁培养，可以预选形态均一的平滑肌细胞，减少后期纯化难度；使用含10-15% fbs的dmem/f-12培养基，适合该细胞快速贴壁和增殖；总体来讲，本发明操作方便，制备成本低，获得的细胞纯度高。

技术特征：

1.一种原代树鼩主动脉弓平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于：将健康树鼩处死开胸腔后，使用含1%青霉素-链霉素的生理盐水执行心脏灌注，灌注结束后，剪取主动脉弓段，清洗，剔除主动脉弓段外残留结缔组织，在解剖镜下，纵向剪开主动脉弓，将内膜外翻，撕去主动脉弓内膜后，将主动脉弓剪成0.8-1.1mm小块，将组织块转移至带培养基的细胞培养24孔板中，每孔放置一个组织块，在37℃、5% co2下培养1小时后补加培养基，继续培养，每隔2天更换新鲜培养基，定期观察细胞生长状况；待细胞基本铺满孔底，选择形态均一的细胞进行传代培养以及扩大培养，其中培养基为含10-15% fbs、1%青霉素-链霉素的dmem/f-12培养基。

2.根据权利要求1所述的原代树鼩主动脉弓平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于：主动脉弓段清洗使用含1%青霉素-链霉素的生理盐水。

3.根据权利要求1所述的原代树鼩主动脉弓平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于：细胞培养孔板中预先加入80-120μl的培养基，1小时后补加180-220μl培养基。

4.根据权利要求1所述的原代树鼩主动脉弓平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于：传代培养是吸弃旧培养基，用含1%青霉素-链霉素的pbs冲洗1次，加入质量体积浓度0.25%胰蛋白酶消化至大部分细胞收缩变圆，加入含10-15%fbs、1%青霉素-链霉素的dmem/f-12培养基终止消化，反复吹打均匀，按1:2的传代比例转入细胞培养孔板继续培养。

技术总结
本发明公开了一种原代树鼩主动脉弓平滑肌细胞的分离培养方法，该方法是在获得树鼩主动脉弓段后，将主动脉弓内膜外翻并撕去主动脉弓内膜后，剪切成小块，将组织块转移至带培养基的细胞培养孔板中，每孔放置一个组织块，采用含10‑15% FBS、1%青霉素‑链霉素的DMEM/F‑12培养基培养，传代扩培后，获得原代树鼩主动脉弓平滑肌细胞；本发明方法在取材前执行心脏灌注，最大限度减少血液等成分对原代培养的干扰，采用单个组织块植入细胞培养孔板进行贴壁培养，减少后期纯化难度；使用含10‑15% FBS的DMEM/F‑12培养基，能使细胞快速贴壁和增殖；本发明操作方便，制备成本低，获得的细胞纯度高。

技术研发人员：王文广,丁相荣,陆彩霞,李娜,代解杰,霍姝汭,杞梦迪,刘欣,仝品芬,孙晓梅
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15