一种基于二代测序的人类个体识别SNP遗传标记组合、检测方法及应用与流程

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于二代测序的人类个体识别snp遗传标记组合、检测方法及应用。

背景技术：

1、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snps)，是指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。其分布密度高、片段短、有较高的遗传稳定性，单个的snp位点扩增产物可以控制在150bp以下，容易实现多个位点的同时扩增，并有利于降解检材的分型。故snps也被认为是继str后的第三代遗传标记，在应用上引起了法医学领域的高度重视。

2、目前，法医行业应用最广泛的dna分型技术是pcr-毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)，其原理是采用多色荧光复合扩增技术，通过检测带有不同荧光基团的扩增片段长度对dna进行分型，为在各色荧光中安置更多的位点，设计引物时一些位点会保留较长的侧翼序列，导致其扩增片段长，不利于降解检材的分型。此外，ce技术目前虽然可以做到一个体系检测40多个str位点，但一次检测需要的样本量较多，对极微量样本检测受限。因此，利用毛细管电泳的一代str分型技术难以处理诸如复杂的亲缘关系鉴定、降解检材身份鉴定或者区分混合样本等。

3、二代测序技术又称为下一代测序技术(next generation sequencing，ngs)。近年来逐渐发展成熟的ngs技术应用于法医领域优势众多：不受荧光标记限制，可以在一个体系中检测大批量的snp位点；更加精准的分析snp分型及序列信息；检测通量大，一次实验可检测几百份样本，并且分析降解检材也更有优势。

4、因此，急需一种能同时检测微量样本中大量snp的体系和精准分型的方法，以便于更准确的进行法医学中微量样本和降解检材的分析。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供一种基于高通量测序的snp位点检测方法，该方法可同时扩增30个snp位点，这些特异性引物对使用cleanplex超高多重pcr技术合成(paragongenomics,usa)。位点号如表1所示。使用的建库试剂盒为cleanplex targeted ultralibrary kit for 2-pool panels(paragon genomics)。

2、本发明的另一个目的是提供上述检测方法进行个体鉴别和提高对降解检材成功分型的应用；检测方法主要流程包括对基因组dna进行文库构建、上机测序和通过数据分析得到所有位点的基因型数据。

3、为了实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案如下：

4、一种基于二代测序的人类个体识别snp遗传标记组合，包括30个snp位点，所述30个snp位点包括：rs10783100、rs10839751、rs1166235、rs4773029、rs8013483、rs10852588、rs11655774、rs12605006、rs2348475、rs530913、rs4588273、rs5748311、rs9849233、rs2613019、rs271397、rs397728、rs2354159、rs1012515、rs7789598、rs6984007、rs1281350、rs3091244、rs2298556、rs3812847、rs3743842、rs941454、rs3816662、rs385780、rs356167、rs2307223。

5、所述30个snp位点分别是：

6、

7、

8、本发明还提供基于二代测序的人类个体识别的snp遗传标记组合的引物组，所述引物组用于检测上述的30个snp位点，所述引物组的序列如seq id no：1～60所示。(表1)：

9、表1：人类snp遗传标记组合引物序列

10、

11、

12、本发明还提供一种用于人类个体识别的扩增体系，所述扩增体系包括检测上述的30个snp位点中的至少20个snp位点的试剂。

13、进一步的，所述试剂包括检测引物和pcr扩增所需试剂；所述检测引物为上述引物组。

14、进一步的，所述扩增体系包括第一次扩增体系和第二次扩增体系；所述第一次扩增体系包括：反应酶和缓冲液预混液2μl、引物混合液2μl、dna样品和ddh2o共6μl；所述第二次扩增体系包括：10μl te buffer洗脱物、二次扩增酶8μl、i5 index primer 2μl、i7index primer 2μl、ddh2o 18μl。

15、进一步的，第一次扩增的pcr反应条件为：95℃预变性10分钟；98℃变性15秒钟、60℃退火5分钟，重复10次；循环结束后，10℃保存；第二次扩增的pcr反应条件为：95℃预变性10分钟；98℃变性15秒钟、60℃退火75秒钟，重复14次；循环结束后，10℃保存。

16、进一步的，第一次扩增后产物使用1.3x ampure xp磁珠纯化，用10μlte buffer洗脱；洗脱后的产物使用试剂盒中的消化酶进行37℃10min金属浴消化，消化体系包括：洗脱产物10μl、消化酶2μl、消化缓冲液2μl、ddh2o 6μl；消化后的产物需要进行二次纯化，使用1.3x ampure xp磁珠纯化，用10μl te buffer洗脱；二次扩增的产物再一次进行1.3xampure xp磁珠纯化，用10μl ddh2o洗脱。

17、进一步的，采用的dna样本浓度为1～10ng/ul。

18、进一步的，dna样本来源于血卡、毛发、指甲或烟头。

19、一种人类个体识别检测方法，包括以下步骤：

20、(1)提取人源dna样本；(2)特异性扩增包含30个snp位点的dna片段，构建dna片段文库，制备ngs测序模板，并对所获得的dna文库进行ngs测序；(3)分析数据，得到所有位点的位点深度信息及基因型数据。

21、本发明还提供一种人类个体识别检测方法，包括以下步骤：

22、(1)dna提取

23、本实施例采用qiaamp dnainvestigator kit(qiagen，germany)对包含血卡、毛发、指甲、烟头不同类型的dna样本进行提取，利用qubit荧光定量方法对dna浓度进行检测，对较高或较低浓度的dna样本进行稀释和浓缩。最终本实施例所有的dna样本的浓度都在1-10ng/ul范围，能够满足后续试验的需求。

24、(2)多重pcr扩增建库

25、使用发明的snp引物组合对所提取的dna样品进行特异性pcr扩增，使用10μl复合扩增体系，包括：反应酶和缓冲液预混液2μl、引物混合液2μl、dna样品+ddh2o共6μl。pcr反应条件为：95℃预变性10分钟；98℃变性15秒钟、60℃退火5分钟，重复10次；循环结束后，10℃保存。

26、扩增后产物使用1.3x ampure xp磁珠纯化，用10μl te buffer洗脱。

27、洗脱后的产物使用试剂盒中的消化酶进行37℃10min金属浴消化，消化体系包括：洗脱产物10μl、消化酶2μl、消化缓冲液2μl、ddh2o 6μl。

28、消化后的产物需要进行二次纯化，使用1.3x ampure xp磁珠纯化，用10μl tebuffer洗脱。

29、二次洗脱产物需要进行二次扩增，40μl扩增体系包括：10μl te buffer洗脱物、二次扩增酶8μl、i5 index primer 2μl、i7 index primer 2μl、ddh2o18μl。pcr反应条件为：95℃预变性10分钟；98℃变性15秒钟、60℃退火75秒钟，重复14次；循环结束后，10℃保存。

30、二次扩增的产物再一次进行1.3x ampure xp磁珠纯化，用10μl ddh2o洗脱，此产物为构建好的dna文库。

31、吸取2μl用于qubit浓度测定，再用2μl用于2％电泳检测片段大小。

32、(3)ngs测序

33、将构建好的文库，按照说明书使用illumina novaseq 6000进行测序。

34、(4)数据分析

35、下机后的测序结果与参考基因组序列比对，使用gatk软件针对本项目panel目标位点call snp，通过位点是否检测到变异来获得样本各位点的snp分型，同时使用sambamba软件统计位点atcg四种碱基类型的深度做为辅助参考。

36、本发明还提供上述引物组在制备人类个体识别试剂盒中的应用。

37、有益效果

38、本发明创造性的提供了基于ngs的一套适用于检测30个常染色体snp的引物组合和检测方法。本发明筛选的snp基因座更适用于中国人群。本发明提供的检测方法，可以实现在微量和降解样本中一次性地检测更多的遗传信息，为准确分型提供了可靠的保证，且具有重复性良好，检测性能高等优点。

39、本发明提供了一种适用于中国人群的snp分型检测方法，一次可以检测30个高分辨率单核苷酸多态遗传标记位点，扩增的片段均一且较短，使每个snp位点的扩增效率尽可能的一致，扩增结果最大程度的保持平衡有效。通过该方法可以对法医学中的降解检材进行鉴定以完成个体识别，其灵敏度高，准确性和重复性好，识别能力强。