一种非天然的抗人CD45RA人源化嵌合抗原受体的制备及用途

本发明属生物技术，涉及一种非天然的抗人cd45ra人源化嵌合抗原受体的制备及用途。采用抗人cd45ra人源化嵌合抗原受体(hu3a4car)基因通过载体转染或感染人t细胞制成hu3a4car-t细胞及其在制备靶向治疗血液系统恶性肿瘤性疾病药物中的用途。

背景技术：

1、根据世界卫生组织癌症研究机构(international agency for research oncancer,iarc)数据,2012年全球恶性肿瘤新发病例超过1400万,死于恶性肿瘤人数约800万,是世界范围内主要死因。恶性肿瘤已经成为主要公共卫生问题,自2010年来,恶性肿瘤已经超过心脑血管疾病,成为第一大死因。白血病是一种最常见的血液系统恶性肿瘤，全球发病率约为4.62/10万，本地区约为5.17/10万，居小儿恶性肿瘤发病和死亡的首位。随着对白血病诊疗的深入研究，新的抗肿瘤药物的不断问世和造血干细胞移植的实施，白血病的预后虽然有了明显的改善，但是，每年的死亡病例仍不在少数，肿瘤复发和治疗相关的并发症是主要原因。据报道，目前成人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)的整体生存率只有30％-40％，仍有20％的儿童all患者出现复发，复发耐药的患者缺乏有效的备选药物，给临床治疗带来了极大的困难。

2、近年来随着分子生物学及抗体工程技术的进步，只杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞的白血病靶向治疗得到了广泛的关注和发展。car-t细胞疗法利用car修饰的t淋巴细胞以主要组织相容性复合物非依赖性方式靶向和消除恶性肿瘤。它结合了car抗体靶标识别的特异性和t细胞的强效效应机制。当这种受体在患者t细胞表面表达时，能够将t细胞重定向到肿瘤细胞上的靶抗原，导致t细胞活化和肿瘤细胞死亡。在b细胞恶性肿瘤患者中抗cd19car-t细胞靶向治疗已经证明可导致持续的疾病缓解和生存时间的延长，car-t细胞在b系肿瘤中成功应用给复发难治性aml的治疗带来新的希望。但与b细胞恶性肿瘤相比，该疗法在治疗aml的临床试验结果则明显差于all，最具挑战性的任务是选择理想的靶标分子，在正常骨髓谱系上存在的aml细胞上靶向抗原会导致严重的中性粒细胞减少，即使病人的aml已被根除，但也会对患者的健康造成破坏性影响。少有靶点被批准用于临床治疗，到目前为止，仅cd123car被美国fda批准用于复发难治性aml的临床治疗，而其他靶点的car仍在进行治疗试验过程中。目前研究发现可通过car-t方法靶向治疗aml的细胞表面靶标包括cd33，cd45，cd123，flt3，lewis-y和cll-1。但效果大多不良，迫切需要寻找新的靶点。在car-t治疗的研究中，为了提高靶向药物对肿瘤的选择性杀伤，减少对非靶向组织的毒副作用，确定一个特异性强的靶点是首要问题。

3、cd45抗原是进化上高度保守的受体蛋白酪氨酸磷酸酶，在造血系统的所有有核白细胞上表达，对于有效的t和b细胞抗原受体信号转导至关重要。可通过分子的胞外域中外显子4(a)，5(b)和6(c)的复杂交替剪接产生多种cd45亚型。cd45在白细胞表面广泛表达，而不表达于其它非造血组织细胞上，这很大程度地避免了脱靶效应导致的其他器官损伤的副作用(a,schraven b,bommhardt u.cd45 in human physiology and clinicalmedicine.immunology letters.2018；196:22-32.)。目前国际上已经采用放射性核素标记的cd45抗体用于造血干细胞移植前的预处理。glatting g利用111in标记的抗cd45单抗yaml568预处理8名骨髓移植患者，生物学分布检测表明红骨髓中的浓度明显高于脾脏、肝脏、肾脏等重要组织，在对骨髓产生明显抑制的同时，机体其它重要脏器功能无明显受损(glatting g,müller m,koop b,hohl k,friesen c,neumaier b,et al.anti-cd45monoclonal antibody yaml568:a promising radioimmunoconjugate for targetedtherapy of acute leukemia.journal of nuclear medicine:official publication,society of nuclear medicine.

4、2006；47(8):1335-41.)。phuong vo在临床ι期试验中发现，10名晚期aml和5名高危骨髓增生异常综合征患者，在hla配型外周血干细胞移植前预处理方案中采用i-抗cd45抗体联合氟达拉滨和2gy全身照射治疗，可达到较理想的骨髓清除作用(vo p,gooley ta,rajendran jg,fisher dr,orozco jj,green dj,et al.yttrium-90-labeled anti-cd45antibody followed by a reduced-intensity hematopoietic cell transplantationfor patients with relapsed/refractory leukemia ormyelodysplasia.haematologica.

5、2020；105(6):1731-7.)。然而，普通cd45抗体不能常规应用于靶向治疗白血病，它可导致患者产生严重的细胞免疫缺陷或嗜中性粒细胞缺乏。

6、cd45ra是cd45分子的一种变构体，在初始t细胞、b细胞、部分粒细胞、部分单核细胞表面表达，而在活化和记忆t细胞、成熟红细胞和血小板及机体其他非造血组织器官细胞上不表达(li s,tang y,zhang j,guo x,shen h.3a4,a new potential target for band myeloid lineage leukemias.journal of drug targeting.2011；19(9):797-804.)。耐药性白血病干细胞(lsc)被认为是急性髓细胞性白血病(aml)治疗后复发的原因。cd45ra在大多数aml患者的白血病细胞中表达。cd45ra是急性髓性白血病中白血病干细胞亚群的特异性标志物(kersten b,valkering m,wouters r,van amerongen r,hanekamp d,kwidama z,et al.cd45ra,a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.british journal of haematology.2016；173(2):219-35.；li s,shen d,guo x,liao c,tang y.construction,expression,andcharacterization of a novel human-mouse chimeric antibody,hm3a4:a potentialtherapeutic agent for b and myeloid lineage leukemias.dna and cellbiology.2018；37(9):778-85.)，开发针对cd45ra抗原的car-t将有可能为白血病临床治疗提供新的靶向治疗方法。car的成功率一方面与靶点调变有关系，另一方面，跟识别靶点单源抗体人源化的程度有关。大多数car是鼠源性的，鼠源性car对人体有免疫原性，其免疫原性激发人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody，hama)反应,可产生人抗鼠scfv抗体，car被中和导致car的功能大大被削弱，hama还引起一些变态反应,包括相对轻微的症状如皮疹、发热和头晕,到严重副反应,如休克和器官衰竭,甚至可能致命。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供一种非天然抗人cd45ra人源化嵌合抗原受体的制备方法，是一种能识别cd45ra抗原阳性白血病细胞的car-t细胞制剂即非天然抗人cd45ra人源化嵌合抗原受体基因(hu3a4car基因)修饰的t细胞(hu3a4car-t)的构建方法：通过t细胞表达car蛋白，特异性地结合人cd45ra抗原。所述嵌合抗原受体的靶向识别区为人cd45ra抗原靶点。hucd45racar或hu3a4car基因由下列结构构成：cd8a leader为car的前导序列(seqid no 1)，人源化cd45ra单链抗体hu3a4scfv为靶向识别区(seq id no 3)、(seq id no5)，cd8a hinge为铰链区(seq id no 7)，cd8a的transmembrane为car跨膜区(seq id no9)，4-1bb(cd137)的胞内信号转导区(seq id no 11)与cd3ζ的胞内信号转导区(seq id no13)串联为完整的人源化cd45racar基因即hucd45racar或hu3a4car基因。

2、通过t细胞表达car蛋白，特异性地结合人cd45ra抗原。所述嵌合抗原受体的靶向识别区为人cd45ra抗原靶点。hu3a4car基因由下列结构构成：cd8a leader(seq id no 1)为car的前导序列，人源化cd45ra单链抗体3a4scfv(seq id no 3)+(seq id no 5)为靶向识别区，cd8a hinge(seq id no 7)为铰链区，cd8a的transmembrane(seq id no 9)为car跨膜区，4-1bb(cd137)的胞内信号转导区(seq id no 11)与cd3ζ的胞内信号转导区(seqid no 13)串联为完整的人源化cd45racar基因即hucd45racar或hu3a4car基因。

3、本发明在现有抗人cd45ra人源化免疫球蛋白(zch-6-hu3a4单抗，简称hu3a4)基因序列基础上，采用分子生物学技术研制出一种非天然的抗人cd45ra的人源化嵌合抗原受体(hu3a4car)，通过以下步骤制备：

4、(1)查询比较文献，确定二代3a4car的基本结构，检索美国国家生物技术信息中心(ncbi)，核实3a4car铰链区(hinge)、跨膜区及胞内信号转导区的基因序列，并委托公司合成puc/hu3a4scfv-4-1bb-3ζ；

5、(2)通过基因工程及分子克隆方法构建hu3a4car的慢病毒表达载体plenti/hu3a4-4-1bb-3ζ；

6、(3)hu3a4-car慢病毒表达载体活性鉴定：检测载体是否表达及蛋白定位是否正确，测定慢病毒表达载体的转染效率。

7、本发明构建了慢病毒表达载体，所述载体包含核苷酸序列cd8a leader(seq idno 1)-hu3a4scfv(seq id no 3)(seq id no 5)-cd8a hinge(seq id no 7)-cd8a跨膜区(seq id no 9)-cd137(seq id no 11)-cd3ζ序列(seq id no 13)，所述的载体是慢病毒载体plenti-hu3a4car基因。

8、本发明提供一种效应细胞，所述的宿主细胞经由上述的表达载体转染而来的人t细胞即hucd45racar-t细胞或hu3a4car-t细胞。

9、本发明的再一个目的是提供所述嵌合抗原受体在制备治疗由表达cd45ra抗原的细胞介导引起的疾病的药物中的应用。所述疾病是指表达cd45ra膜抗原相关肿瘤性疾病主要为恶性血液病，具体指急性髓系白血病，急性淋巴细胞白血病，恶性淋巴瘤，慢性髓系白血病和慢性淋巴细胞白血病。

10、本发明所提供的慢病毒表达载体即plenti-hu3a4car用于hu3a4car-t细胞的药物制备，可用于cd45ra阳性白血病、淋巴瘤等患者的治疗。本发明的慢病毒表达载体plenti-hu3a4-4-1bb-3ζ即plenti-cd45racar基因表达载体可成功感染人t细胞，研制成hu3a4car-t细胞可以有效杀伤cd45ra(3a4)阳性靶细胞kg1a细胞和raji细胞。hu3a4car-t细胞识别靶抗原不依赖于抗原呈递过程，也不受主要组织相容性复合物(mhc)的限制，因而可以克服肿瘤免疫逃避，更有效地杀伤3a4阳性肿瘤细胞。

11、本发明的有益之处是:本发明利用精心研制得到的非天然hucd45racar(hu3a4car)蛋白，其识别抗原不依赖于抗原呈递过程，也不受mhc限制，因而可以克服肿瘤免疫逃避，更有效地杀伤3a4阳性肿瘤细胞。本发明利用研制得到的非天然hucd45racar(hu3a4car)进行了一系列的实验。hu3a4car顺利感染人t细胞制成hu3a4car-t细胞后，体外抗原结合活性测定结果表明hu3a4car-t能很好地与高表达cd45ra的髓系白血病细胞系kg1a特异性地结合。hu3a4car-t细胞可靶向杀伤3a4阳性细胞株和新发aml患者体内的白血病细胞。hu3a4car-t细胞可减轻人抗鼠抗体反应，可明显降低抗scfv抗体的产生，从而保证car的杀伤活性。

12、本发明提出用人源化car，可减轻人抗鼠抗体反应，可明显降低抗scfv抗体的产生，从而保证car的杀伤活性；为此，3a4抗体已进行了人源化改造，取名为hu3a4，人源化程度达到93％。由于单克隆抗体的亲和力和特异性主要是由抗体轻链和重链的超可变区(或称互补决定区，complementary determinant region，简称cdr)的氨基酸序列决定的，任何具有相同cdr序列的单克隆抗体，其识别靶抗原的特异性、亲和力和所发挥的治疗作用基本相同。在获得一种有临床治疗价值的鼠源抗体序列之后，通过将其非cdr区域(框架区)的氨基酸序列进行人源化改造能够获得具有相同生物活性的人源化单克隆抗体。hu3a4可特异性结合杀伤髓系和b系lscs，利用hu3a4单抗构建hu3a4-car，靶向杀伤白血病干细胞和治疗难治性aml具有重要科学意义及临床应用前景。