用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物工程，具体涉及一种用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌及其制备方法和应用。

背景技术：

1、番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒(mdrv)引起的一种传染病，发病率和病死率都比较高。番鸭呼肠孤病毒(mdrv)可引起番鸭以及半番鸭肝脏、脾脏等脏器表面有大量白色坏死点，故又称为鸭“白点病”，所引起的樱桃谷鸭脾脏坏死也被称为“鸭脾坏死症”。番鸭发生呼肠孤病毒病多发生于7-35日龄，常见于10-25日龄，潜伏期3-11天左右。患有番鸭呼肠孤病毒病的番鸭会出现较为明显的生长发育缓慢、免疫抑制，并且易于诱发如鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏菌等严重的继发感染。水禽呼肠孤病毒是导致水禽疫病复杂化的主要元凶，也是当前水禽疫病防控的重点和难点。这给水禽养殖业带来极大的危害。寻求防控水禽呼肠孤病毒已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。

2、纳米抗体是由重链抗体可变区(vhh)构成的最小功能性抗原结合活性片段，具有相对分子质量小、亲合力和稳定性高、溶解性好、特异和穿透性强、易于基因改造及表达、生产成本低、形式模块化和免疫原性弱等优势，表现出更好的应用价值，在新型生物制剂研发方面表现出巨大潜力。目前，尚未有关于抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的研究报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌及其制备方法和应用。

2、本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

3、本发明提供的一种用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌，其核苷酸序列见seq id no:3。

4、本发明提供的一种用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌的制备方法，主要包括以下步骤：

5、将番鸭呼肠孤病毒病活疫苗(ca株)注射雄性羊驼，收集羊驼外周血并分离出淋巴细胞，抽提其rna并反转录成cdna，利用两轮套式pcr扩增羊驼抗体的vhh序列；将获得的vhh序列与pcomb3xss质粒经限制性内切酶sac i和spe i消化后用t4连接酶连接，转化至大肠杆菌tg1感受态，挑取单菌落进行鉴定构建免疫羊驼vhh噬菌体文库；筛选能与水禽呼肠孤病毒结合的vhh序列；将筛选到的vhh序列与ppic9k载体经限制性内切酶ecori和noti消化后回收目的片段，用t4连接酶连接并转化至大肠杆菌dh5α感受态，过夜培养，挑取单菌落进行测序鉴定，获得重组质粒ppic9k-mdrv-nb028；将线性化后的重组质粒ppic9k-mdrv-nb028加入到毕赤酵母x-33感受态细胞中进行电转化，加入山梨醇吸打后静置培养，离心收集菌体，重悬、涂布培养后挑取单菌落进行鉴定，获得用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌。

6、其中，所述能与水禽呼肠孤病毒结合的vhh序列的核苷酸序列见seq id no:1，编码的氨基酸序列见seq id no:2。

7、其中，所述重组工程菌的长度为369bp。

8、本发明提供的一种抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体，采用上述的重组工程菌进行制备。

9、其中，本发明提供的一种抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体，其核苷酸序列见seqid no:1，编码的氨基酸序列见seq id no:2。

10、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

11、本发明的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌，制备方法简单，能够提高所生产的重组纳米抗体的产量和活性，适用于大规模低成本化生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体。本发明所制备的重组纳米抗体，其产量达到7.8mg/l，中和效价为6log2，具有较高的生物学活性，能够应用于预防和/或治疗水禽呼肠孤病毒病。本发明填补了抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体领域的空白，所制备的抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体与目前的水禽呼肠孤病毒株之间的结合适配性较好。

技术特征：

1.用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌，其特征在于，其核苷酸序列见seq id no:3。

2.如权利要求1所述的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌的制备方法，其特征在于，所述能与水禽呼肠孤病毒结合的vhh序列的核苷酸序列见seq idno:1，编码的氨基酸序列见seq id no:2。

4.根据权利要求2所述的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌的制备方法，其特征在于，所述重组工程菌的长度为369bp。

5.一种抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体，其特征在于，采用权利要求1所述的重组工程菌进行制备。

6.根据权利要求5所述的一种抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体，其特征在于，其核苷酸序列见seq id no:1，编码的氨基酸序列见seq id no:2。

技术总结
用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌及其制备方法和应用，涉及生物工程领域，该重组工程菌的核苷酸序列见SEQ ID NO:3，其长度为369bp。由该重组工程菌制备的抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的核苷酸序列见SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。本发明的重组工程菌，其制备方法简单，能够提高所生产的重组纳米抗体的产量和活性，适用于大规模低成本化生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体。本发明所制备的重组纳米抗体，其产量为7.8mg/L，中和效价为6log<subgt;2</subgt;，具有较高的生物学活性，能够应用于预防和/或治疗水禽呼肠孤病毒病。

技术研发人员：刘大方,钱晶,闫荣亮,李娜,王允磊,刘双双,卞金辉,孙卫东
受保护的技术使用者：江苏大方生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15