Ⅰ型及Ⅱ型鹅星状病毒荧光定量PCR引物及试剂盒

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种ⅰ型及ⅱ型鹅星状病毒荧光定量pcr引物及试剂盒。

背景技术：

1、鹅痛风又称尿酸盐沉积症，是由鹅星状病毒(goose astrovirus，goastv)引起的一种以雏鹅的肾脏、心包、肝脏等内脏及关节出现大量尿酸盐沉积为主要特征的急性传染性疾病。该病主要感染5～20日龄的雏鹅，且日龄越小，其发病率和死亡率越高。该病无明显季节性，一年四季均可发生，常呈地方流行性。本病自2016年在我国部分养鹅地区出现以来，现已在山东、河北、安徽、江苏、河南、辽宁、黑龙江、四川、广东、江西、福建等多地发生和流行，发病率30％～50％，病死率可达50％，已成为严重危害我国养鹅业的主要疫病之一。

2、目前研究结果显示，我国鹅群中存在两种不同基因型goastv，即ⅰ型鹅星状病毒(ⅰ-goastv)，及ⅱ型鹅星状病毒(ⅱ-goastv)，又被称为新型鹅星状病毒。两种goastv全基因组核苷酸同源性仅为60％左右，但是引起的临床症状无明显差异，且常常存在混合感染的情况，导致鹅星状病毒的感染现状越来越复杂，为鹅星状病毒的科学防控带来困难。

3、如专利申请文件cn116103441a，公开了一种用于检测1型和2型鹅星状病毒的多重荧光pcr引物探针组，对样本进行检测，gastv-1和gastv-2的检测灵敏度均可达到10拷贝数/μl，均比常规pcr方法敏感100倍。gastv-1的组内和组间变异系数分别为0.10-0.34％和0.28-0.60％；gastv-2的组内和组间变异系数分别为0.24-0.86％和0.32-0.59％，组内和组间重复性良好。

4、荧光定量是通过分析收集反应中的荧光信号后对检测结果判定，sybr荧光染料中sybr与双链dna进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定pcr反应是否特异，多重荧光pcr方法具有检测效率高，即多重荧光pcr可以实现一管多检，简化操作流程；节省试剂成本和人员操作时间，尤其在开展大量样品检测时，显著地降低检测成本和操作时间等优势。sybrgreen染料法荧光定量pcr的性价比较高，可避免核酸电泳的污染也节省检测时间。

5、其他的检测方法还有如elisa抗体检测、pcr、重组酶介导检测(raa)、环介导等温扩增(lamp)等，但都存在不同的缺陷，如elisa抗体检测：重复性不好且受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性。pcr：虽然简便快速，但与荧光定量pcr相比需要更长时间。重组酶介导检测(raa)：在酶介导下的恒温快速扩增，降低对设备的要求，不过对引物两端有要求，要重新设计引物。环介导等温扩增(lamp)：在实验过程中由于开盖造成的气溶胶污染，检测结果容易出现假阳性。

技术实现思路

1、基于此，为解决现有技术中存在的至少一种技术问题，本发明基于荧光定量pcr技术，根据ⅰ型及ⅱ型鹅星状病毒orf2基因设计并合成2对特异性引物及检测盒，能同时实现ⅰ型和ⅱ型鹅星状病毒的双重荧光定量检测，且特异性强、灵敏度高、重复性好，操作简便快捷具有广泛市场应用前景。

2、本发明一方面提供了一种ⅰ型及ⅱ型鹅星状病毒荧光定量pcr引物，所述引物包括第一引物对，和/或第二引物对，其中，

3、第一引物对：上游引物ⅰ-f tggatgtagtggctgacgc(seq id no：1)，

4、下游引物ⅰ-r ttgcatatttcgaggttgc(seq id no：2)；

5、第二引物对：上游引物ⅱ-f cagactccaggtcaagata(seq id no：3)，

6、下游引物ⅱ-r gtcataacagcccaccaat(seq id no：4)。

7、第一引物对的目的片段大小为114bp，第二引物对的目的片段大小为109bp。

8、本发明另一方面提供了一种ⅰ型及ⅱ型鹅星状病毒荧光定量pcr试剂盒，包括上述的引物。

9、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括阳性标准质粒，所述阳性标准质粒为重组质粒t-goastv-orf2。

10、在其中一些实施例中，所述阳性标准质粒的浓度梯度范围为1.12×101-1.12×107copies/μl。

11、在其中一些实施例中，所述阳性标准质粒的制备包括如下步骤：

12、(1)目的片段的pcr扩增以及纯化：分别使用第一引物对ⅰ-r、ⅰ-f以ⅰ型鹅星状病毒cdna为模板，第二引物对ⅱ-r、ⅱ-f以ⅱ型鹅星状病毒cdna为模板，对目的片段进行pcr扩增，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；

13、(2)目的片段的连接及转化：将纯化后的扩增产物与pmd18-t vector载体连接，转化至感受态细胞，涂布与amp-lb琼脂平板，37℃培养12-16h；

14、(3)重组质粒的筛选及鉴定；筛选生长良好的单菌落培养，取疑似阳性的菌液作为模板进行pcr鉴定，测序；

15、(4)阳性标准质粒的提取；将测序结果正确的菌液扩大培养后，提取得到重组质粒作为阳性标准质粒。

16、在其中一些实施例中，所述步骤(1)中，pcr反应体系总量20μl；其中，takarapremix taq为12.5μl，第一引物对/第二引物对上游引物1.0μl，第一引物对/第二引物对下游引物1.0μl，模板2.0μl，余量为ddh2o，反应程序为：①95℃持续3min；②95℃持续30s，③55℃持续30s，④72℃持续40s，②-④30个循环；⑤72℃持续7min，12℃保存。

17、在其中一些实施例中，所述步骤(2)中，与pmd18-t vector载体连接混匀后，置金属浴仪中16℃作用4h，4℃过夜，获得连接产物。

18、在其中一些实施例中，所述步骤(3)中，pcr鉴定反应体系如下：反应体系总量10μl；其中，takara premix taq为5μl，第一引物对/第二引物对上游引物0.5μl，第一引物对/第二引物对下游引物0.5μl，菌液1.0μl，余量为ddh2o，反应程序为：①95℃持续3min；②95℃持续30s，③55℃持续30s，④72℃持续40s，②-④30个循环；⑤72℃持续7min，12℃保存。

19、在其中一些实施例中，所述试剂盒的pcr反应体系如下：反应体系总量20μl；其中，tb green premix ex taqⅱ为10μl，ⅰ-f上游引物、ⅰ-r下游引物各为0.8μl，ⅱ-f上游引物、ⅱ-r下游引物各为1.5μl，模板2.0μl，余量为ddh2o，所述模板为ⅰ型鹅星状病毒cdna及ⅱ型鹅星状病毒cdna；反应程序为：①95℃持续3min；②95℃持续3s，③64℃持续30s，②-③40个循环，⑤熔解曲线程序按设备ariamx real-time pcr g8830a默认设置，上下游引物ⅰ-f、ⅰ-r，ⅱ-f、ⅱ-r浓度均为10μmol/l。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、1)特异性强：对鸭坦布苏病毒(dtmuv)、番鸭呼肠孤病毒(mdrv)、新型鸭呼肠孤病毒(ndrv)、禽流感病毒(ai)、禽腺病毒(fadv)、鹅细小病毒(gpv)核酸进行扩增，以ddh2o为模板作为阴性对照，该体系不与其他病毒反应，特异性强。

22、2)灵敏度高：用107copies/μl～101copies/μl的18t-ⅰ-goastv和18t-ⅱ-goastv单一质粒标准品及混合质粒标准品为模板，depc water为阴性，使用本发明的检测体系进行qpcr扩增，测定单重及双重荧光定量方法检测的最低拷贝数，并使用普通pcr进行检测作为对比，本发明检测体系的最低检测限为1.12x101copies/μl，是普通pcr方法的100倍。

23、3)重复性好：将质粒按以1.12×105copies/μl～1.12×107copies/μl共三个稀释度作为反应模板，按照优化好的反应体系，每个样品重复检测3次并设置阴性对照，变异系数(cv)均小于1％，重复性良好。