用于法医鉴定中mtDNA测序的试剂盒及其专用引物组和应用的制作方法

本发明属于法医鉴定领域，涉及用于法医鉴定中mtdna测序的试剂盒及其专用引物组和应用。

背景技术：

1、线粒体dna(mitochondrial dna，mtdna，又称：线粒体基因组)呈双链闭合环状，全长16569bp左右，具有母系遗传、拷贝数高、环状结构稳定等特点，在法医dna检测中具有极其重要的应用价值。传统的mtdna检测方法多是基于毛细管电泳的sanger测序方法，且仅关注mtdna的高变区序列。随着二代测序技术的出现及应用，基于二代测序技术的线粒体全基因组检测方法可获得更多的遗传数据、对线粒体单倍型的区分能力更强，且兼具通量大、灵敏度高、集成化、低成本等优势。目前国内外相继基于修正后的剑桥参考序列(rcrs)等来源于欧美人群的常用标准序列开发了一些商品化二代测序线粒体全基因组检测试剂盒。由于欧美人群和中国人群分别属于不同的线粒体单倍群，即欧美人群的mtdna序列与中国人群的mtdna序列存在较大差异，这些商品化试剂盒的引物体系在用于中国人群mtdna检测时，会出现其引物不能与中国人群mtdna高度匹配的问题，导致部分片段的扩增效率较差，影响测序深度的稳定性和测序结果的准确性。同时，这些商品化线粒体全基因组检测试剂盒多以进口为主，价格昂贵，限制了线粒体全基因组检测在法医检验鉴定中的应用。

2、核线粒体dna片段，简称numts(nuclear mitochondrial sequences)，是指从线粒体基因组转移至细胞核并插入核基因组的dna序列。研究发现大部分numts在过去10万年内完成了向核基因组的转移，并且在核基因组持续存在。由于numts序列和mtdna同源，片段序列高度相似，所以在mtdna检测中会产生数据干扰，影响检验结果。随着二代测序线粒体基因组检测的法医应用，将目标部分从线粒体高变区扩展到整个线粒体基因组，使得numts对mtdna测序数据的干扰尤为明显，特别是在法医mtdna检验中为了针对降解检材而设计的迷你扩增子也会比其他富集方法产生更多的numts数据。目前，虽然国内外也相继建立了numts数据库，尝试在mtdna测序数据分析阶段实现对numts的过滤，但是这种后端numts的过滤无法实现100％的过滤，而且对于一些核dna比较丰富的检材样本，上述后端过滤numts的方法无法避免numts在检测阶段占用较多测序资源。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供用于法医鉴定中mtdna测序的试剂盒及其专用引物组和应用。

2、本发明提供了一种引物组合，由244种引物组成；244种引物的核苷酸序列依次如seq id no:1至seq id no:244所示。

3、本发明还提供了一种引物组合，由引物组mt-p1和引物组mt-p2组成；引物组mt-p1由122种引物组成，依次如seq id no:1至seq id no:122所示；引物组mt-p2由122种引物组成，依次如seq id no:123至seq id no:244位所示。

4、本发明还保护以上任一所述引物组合在mtdna测序中的应用。

5、本发明还保护以上任一所述引物组合在对法医鉴定样本进行mtdna测序中的应用。

6、本发明还保护以上任一所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于mtdna测序。

7、本发明还保护以上任一所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于对法医鉴定样本进行mtdna测序。

8、本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述引物组合。

9、所述的试剂盒中，引物组mt-p1和引物组mt-p2分别独立包装。

10、本发明还保护以上任一所述所述试剂盒在mtdna测序中的应用。

11、本发明还保护以上任一所述试剂盒在对法医鉴定样本进行mtdna测序中的应用。

12、引物均为单链dna分子。

13、将seq id no:1所示引物命名为引物1，将seq id no:2所示引物命名为引物2，以此类推。

14、具体的，引物组合中，引物1至引物244的摩尔配比依次如下：0.6：0.6：0.2：0.2：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.2：0.2：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.15：0.15：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.2：0.2：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.15：0.15：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.25：0.25：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.6：0.6：0.1：0.1：0.1：0.1：0.4：0.4：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.2：0.2：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.25：0.25：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.6：0.6：0.4：0.4：0.1：0.1。

15、具体的，引物组mt-p1中，引物1至引物122的摩尔配比依次如下：0.6：0.6：0.2：0.2：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.2：0.2：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.15：0.15：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.2：0.2：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.15：0.15：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.25：0.25：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.6：0.6：0.1：0.1。

16、具体的，引物组mt-p1中，引物1至引物122的工作浓度依次如下：0.6μm、0.6μm、0.2μm、0.2μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.2μm、0.2μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.05μm、0.05μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.05μm、0.05μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.15μm、0.15μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.2μm、0.2μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.15μm、0.15μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.25μm、0.25μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.6μm、0.6μm、0.1μm、0.1μm。

17、具体的，引物组mt-p2中，引物123至引物244的摩尔配比依次如下：0.1：0.1：0.4：0.4：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.2：0.2：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.25：0.25：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.6：0.6：0.4：0.4：0.1：0.1。

18、具体的，引物组mt-p2中，引物123至引物244的工作浓度依次如下：0.1μm、0.1μm、0.4μm、0.4μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.05μm、0.05μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.05μm、0.05μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.2μm、0.2μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.25μm、0.25μm、0.1μm、0.1μm、0.05μm、0.05μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.1μm、0.6μm、0.6μm、0.4μm、0.4μm、0.1μm、0.1μm。

19、所述应用中，mtdna测序包括如下步骤：

20、(1)从供试样本中提取dna，即为供试dna样本，调整dna浓度，得到模板溶液；

21、(2)取步骤(1)得到的模版溶液，分别进行两个体系的多重pcr扩增(两个体系分别命名为mt-p1体系和mt-p2体系)，mt-p1体系采用引物组mt-p1，mt-p2体系采用引物组mt-p2；

22、(3)将步骤(2)得到的两个体系的扩增产物进行dna纯化后混合，然后进行文库制备，得到文库溶液；

23、(4)取文库溶液，进行高通量测序。

24、供试样本为具有人dna的样本，例如毛发、血卡、口腔拭子、接触脱落细胞等。

25、mt-p1体系(20μl)：4μl引物组mt-p1、10μl 2×master mix，1-6μl模板溶液，余量为无核酸酶水。引物组mt-p1提供的有效成分为表1中列出的各个引物，各个引物在体系中的浓度见表1的最后一列工作浓度。

26、mt-p2体系(20μl)：4μl引物组mt-p2、10μl 2×master mix，1-6μl模板溶液，余量为无核酸酶水。引物组mt-p2提供的有效成分为表2中列出的各个引物，各个引物在体系中的浓度见表2的最后一列工作浓度。

27、2×master mix：含40mm tris-hcl、3.2mm mgcl2、100mm kcl、0.04g/100ml nan3、6.4％(体积百分含量)甘油、0.4％(体积百分含量)吐温20、1.6mg/ml牛血清白蛋白、400mmdntp、0.2u/μl taq dna polymerase(roche公司产品，货号为11147633103)，余量为水。

28、多重pcr扩增的反应程序均为：95℃5min；95℃30s、60℃2min、72℃2min，25个循环；72℃5min；4℃保存。

29、示例性的，文库制备采用mgieasy扩增子文库制备试剂盒。

30、mgieasy扩增子文库制备试剂盒(mgieasy ampseq library prep kit)：mgi公司，产品目录号为940-200039-00，试剂盒版本号为v1.0。

31、示例性的，所述高通量测序为二代测序。

32、示例性的，二代测序采用测序试剂mgiseq-2000rs high-throughput sequencingset(se400)在mgiseq-2000二代测序仪(mgi公司)进行。

33、mgiseq-2000rs high-throughput sequencing set(se400)：mgi公司，产品目录号为1000013857。

34、所述测序样本为中国人。

35、所述测序样本为中国汉族人。

36、所述测序样本为中国男性。

37、所述测序样本为中国汉族男性。

38、所述法医鉴定样本为来源于中国人的样本。

39、所述法医鉴定样本为来源于中国汉族人的样本。

40、所述法医鉴定样本为来源于中国男性的样本。

41、所述法医鉴定样本为来源于中国汉族男性的样本。

42、为了解决现有技术中的问题，本发明基于中国人群线粒体全基因组遗传特点建立中国人群的线粒体全基因组平均序列，并基于该平均序列进行引物设计。在引物设计的同时，发明人按照中国人群的线粒体遗传特点，找到numts和对应mtdna序列的差异碱基，把引物的3’端设计在差异碱基上，如此避免numts序列被扩出。以此构建符合中国人群的线粒体全基因组检测体系，实现对中国人群线粒体全基因组的精准检验。

43、本发明的主要创新点：①首次基于具有中国人群线粒体全基因组遗传特点的平均序列开发中国人群线粒体全基因组检测体系；②首次在引物设计阶段制定规避numts干扰的策略，使扩增到的线粒体来源的序列达到99％以上。

44、本发明可通过相对低的检测成本得到更精准的检测结果，既使得二代测序线粒体全基因组检测技术更大地惠及实战应用，又满足国产装备保障的需求，预期国内经济效益显著。