本发明涉及微生物,具体地说,涉及生产4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的重组微生物及其构建方法与应用。
背景技术:
1、减少化石资源的依赖对于减少二氧化碳的排放,实现碳达峰和碳中和的目标具有重要的意义,因此近年来利用可再生生物质作为原材料进行各种工业化学品的生物生产得到了广泛关注。其中,4-羟基丁酸(4-hb)是一种生产各种c4化学品的重要中间体,可以用于生产生物基1,4-丁二醇(1,4-bdo)(nat chem biol 2011,7:445–452)和γ-丁内酯(metabolic engineering,2013,20:73-83)。此外,聚-4-羟基丁酸是一种生物相容性热塑性材料,具有良好的拉伸强度,并可用作各种生物聚合物中的医疗植入材料。而以1,4-bdo为原料生产的可降解塑料如pbat、pbs等,具有较好的延展性、耐热性和抗冲击性能,是替代传统塑料的重要选择。
2、因此,有必要对如何通过生物生产法实现4-hb和1,4-bdo的高效生产进行进一步研究。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于提供一种副产物生成量低、4-羟基丁酸或1,4-丁二醇产量高的重组微生物及其应用。
2、为了实现该目的,本发明的技术方案如下:
3、一种重组微生物,所述重组微生物与出发菌株相比,具有降低的gabd基因表达量,或具有降低的gabd基因和ldh基因表达量,或具有降低的gabd基因、ldh基因和ald基因表达量;所述出发菌株为可合成4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的谷氨酸棒杆菌。
4、本发明在利用谷氨酸棒杆菌生产4-hb和1,4-bdo的生物合成路径,发现中间产物琥珀酸半醛会在细胞内源的醛脱氢酶的作用下通过氧化途径生成琥珀酸,降低了流向4-hb和1,4-bdo的代谢流量。本发明通过研究发现,通过敲除或失活谷氨酸棒杆菌中的醛脱氢酶基因gabd,乳酸脱氢酶基因ldh和醛脱氢酶基因ald中的一个或多个,可以显著减少菌株发酵过程中琥珀酸和乳酸等副产物的积累,提高4-hb和1,4-bdo的产量。
5、优选,通过组合敲除谷氨酸棒杆菌中的两个关键基因gabd和ldh来提升发酵生产4-hb和1,4-bdo的效果。
6、更优选,通过组合敲除谷氨酸棒杆菌中的三个关键基因gabd、ldh和ald来提升发酵生产4-hb和1,4-bdo的效果。
7、本发明的重组微生物中,所述gabd基因的核苷酸序列如seq idno.1所示,所述ldh基因的核苷酸序列如seq id no.2所示,所述ald基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
8、本发明的重组微生物中,所述出发菌株中过表达谷氨酸脱羧酶基因gadbe89qδ465-466,转氨酶基因gabt和醇脱氢酶基因yqhd,从而使出发菌株可发酵生产4-羟基丁酸。
9、本发明的重组微生物中,所述谷氨酸脱羧酶基因gadbe89qδ465-466的核苷酸序列如seq id no.4所示,所述转氨酶基因gabt的核苷酸序列如seq id no.5所示,所述醇脱氢酶基因yqhd的核苷酸序列如seq id no.6所示。
10、本发明的重组微生物中,所述出发菌株中进一步过表达羧酸还原酶基因car和spf基因,并进一步提升所述醇脱氢酶基因yqhd的表达量。
11、本发明通过在出发菌株中进一步导入含有car、spf和yqhd基因的质粒,从而使出发菌株可发酵生产1,4-丁二醇。
12、本发明的重组微生物中,所述羧酸还原酶基因car的核苷酸序列如seq id no.7所示,所述spf基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。
13、本发明的目标基因过表达可通过在出发菌株中导入含有目标基因序列的质粒实现,本发明的目标基因表达量降低可通过从出发菌株中敲除或失活目标基因实现。
14、本发明还提供上述重组微生物的如下任一种应用:
15、(1)在发酵生产4-羟基丁酸或1,4-丁二醇中的应用;
16、(2)在用于生产4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的微生物遗传育种中的应用;
17、(3)在提高生物法合成4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的产量中的应用;
18、(4)在降低生物法合成4-羟基丁酸或1,4-丁二醇时的副产物生成量中的应用。
19、本发明的应用中,所述副产物为琥珀酸和乳酸。
20、本发明再提供一种发酵生产4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的方法,其包括培养上述重组微生物的步骤。
21、本发明另提供一种构建生产4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的重组微生物的方法,其包括使出发菌株降低gabd基因的表达量,或降低gabd基因和ldh基因的表达量,或降低gabd基因、ldh基因和ald基因的表达量;所述出发菌株为可合成4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的谷氨酸棒杆菌;所述gabd基因的核苷酸序列如seq id no.1所示,所述ldh基因的核苷酸序列如seq id no.2所示,所述ald基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
22、本发明构建了4-hb和1,4-bdo生产的谷氨酸棒杆菌重组菌株,通过表达大肠杆菌来源的谷氨酸脱羧酶基因gadbe89qδ465-466,转氨酶基因gabt和醇脱氢酶基因yqhd实现4-hb的生产,进一步通过表达mycobacterium marinum来源的羧酸还原酶基因car和bacillussubtilis来源的spf和大肠杆菌来源的醇脱氢酶基因yqhd实现1,4-bdo的生物合成。
23、优选,本发明出发菌株为谷氨酸棒杆菌s9114。
24、本发明的有益效果至少在于:
25、本发明提供了一种改造谷氨酸棒杆菌的代谢工程策略,通过敲低或者敲除谷氨酸棒杆菌株中的gabd,ldh和醛脱氢酶基因ald中的一个或多个,降低副产物的积累,从而显著提高4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的产量和生产效率。
1.一种重组微生物,其特征在于,所述重组微生物与出发菌株相比,具有降低的gabd基因表达量,或具有降低的gabd基因和ldh基因表达量,或具有降低的gabd基因、ldh基因和ald基因表达量;所述出发菌株为可合成4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的谷氨酸棒杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组微生物,其特征在于,所述gabd基因的核苷酸序列如seqid no.1所示,所述ldh基因的核苷酸序列如seq id no.2所示,所述ald基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组微生物,其特征在于,所述出发菌株中过表达谷氨酸脱羧酶基因gadbe89qδ465-466,转氨酶基因gabt和醇脱氢酶基因yqhd。
4.根据权利要求3所述的重组微生物,其特征在于,所述谷氨酸脱羧酶基因gadbe89qδ465-466的核苷酸序列如seq id no.4所示,所述转氨酶基因gabt的核苷酸序列如seq idno.5所示,所述醇脱氢酶基因yqhd的核苷酸序列如seq id no.6所示。
5.根据权利要求3或4所述的重组微生物,其特征在于,所述出发菌株中进一步过表达羧酸还原酶基因car和spf基因,并进一步提升所述醇脱氢酶基因yqhd的表达量。
6.根据权利要求5所述的重组微生物,其特征在于,所述羧酸还原酶基因car的核苷酸序列如seq id no.7所示,所述spf基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。
7.权利要求1-6任一项所述的重组微生物的如下任一种应用:
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述副产物为琥珀酸和乳酸。
9.一种发酵生产4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的方法,其特征在于,包括培养权利要求1-6任一项所述的重组微生物的步骤。
10.一种构建生产4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的重组微生物的方法,其特征在于,包括使出发菌株降低gabd基因的表达量,或降低gabd基因和ldh基因的表达量,或降低gabd基因、ldh基因和ald基因的表达量;所述出发菌株为可合成4-羟基丁酸或1,4-丁二醇的谷氨酸棒杆菌;所述gabd基因的核苷酸序列如seq id no.1所示,所述ldh基因的核苷酸序列如seqid no.2所示,所述ald基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。