水稻中胚轴基因GSK2等位基因的分子标记及其检测的引物和方法与流程

本发明涉遗传学和植物育种领域，具体为一种筛选水稻中胚轴长度基因gsk2等位基因的分子标记、扩增或检测分子标记的引物以及检测方法。

背景技术：

1、水稻(oryza sativa)是世界上最重要的谷类作物之一，是世界上一半以上的人口的粮食来源。为减少劳动力和资源成本，水稻直播特别是机械化直播在亚洲已被广泛采用(farooq et al.，2011；zhou et al.，2019)。幼苗从深层土壤中均匀出苗后形成的能力，称为出苗活力，使品种适合直播。然而，大多数现代水稻品种在直播后出苗活力较差，这导致种子使用量和资源成本增加(mahender et al.，2015)。

2、对于水稻(oryza sativa)来说，胚芽鞘是幼苗的一个基本结构，它在幼苗穿过土层时保护幼苗。位于胚芽鞘下面的中胚轴，在黑暗中发育，它把胚芽鞘的基部推向土壤表面。中胚轴和胚芽鞘的伸长受各种遗传和环境因素的调节，这些因素刺激水稻幼苗的出苗(takahashi,1978；helms et al.，1989；dilday et al.，1990)。

3、中胚轴是把水稻幼苗的子叶和胚芽鞘分开的结构，中胚轴较长的品种出苗活力增加，使直播变得可行(詹等，2020)。野生稻和许多古老的地方品种在深层土壤或黑暗中发芽时具有长中胚轴表型。然而，大多数现代品种中胚轴较短(doebley et al.，2006)。

4、目前虽然已经检测到许多控制水稻中胚轴伸长的qtl，但只有少数位点被精细定位和克隆。水稻gsk2是一种参与油菜素类固醇信号传导的gsk 3样激酶，利用gwas方法鉴定其控制水稻中胚轴长度。

5、中胚轴较短的水稻出苗率低，需要与其他中胚轴较长的水稻杂交，再通过回交或自交，在后代中选择获得中胚轴较长的品种。过去在判断水稻中胚轴长度的品种时，育种者主要通过逐一测量不同水稻的中胚轴的长度来判断该品种是否是中胚轴较长的品种。但该方法费时且费力。随着各种分子标记的发展，许多重要农艺性状和品质性状的分子标记被开发用于水稻育种。

6、因此，需要提供一种分子标记、相应的引物和检测方法来辅助培育和筛选具有对应相对较长中胚轴长度的品种，从而增加水稻的产量，显得十分重要。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种筛选水稻中胚轴长度基因gsk2等位基因的分子标记gsk2(taql-v2)及应用。

2、本发明还提供了检测该分子标记的引物及方法，能够快速并准确地鉴定gsk2的不同等位基因型，可用来辅助培育筛选具有较长中胚轴长度的水稻。

3、本发明技术方案为，gsk2基因在控制水稻中胚轴长度方面的应用。尤其是第3319位碱基的g/a多态性可用于控制水稻中胚轴长度。

4、水稻gsk2主要分两种基因型：gsk23319g基因型和gsk23319a基因型；在编码区3319bp位置处存在g/a的多态性。

5、对自然群体水稻gsk2基因序列分析发现，水稻gsk2基因单倍型主要分a型和b型两种，a单倍型gsk2和b单倍型gsk2在编码区3319bp位置处存在g/a的多态性(sun et al.2018年)。因此，gsk23319g可以代表a单倍型gsk2，gsk23319a可以代表b单倍型gsk2。

6、gsk23319a基因型水稻具有相对较长的中胚轴长度，编码区3317bp-3320bp处为tcaa；gsk23319g基因型水稻具有相对较短的中胚轴长度，编码区3317bp-3320bp处为tcga。

7、本发明的另一个技术方案为，一种控制水稻中胚轴长度基因gsk2的分子标记(以下简称gsk2(taql-v2))，gsk23319g基因型水稻中，gsk2编码区3317bp-3320bp处为tcga；gsk23319a基因型水稻中，gsk2基因编码区3317bp-3320bp处为tcaa。

8、分子标记gsk2(taql-v2)位于中胚轴长度基因gsk2编码区3317bp-3320bp处。在gsk23319g基因型水稻中，该位点的4个核苷酸序列“tcga”能够被限制性核酸内切酶taql-v2识别并剪切，而gsk23319a基因型水稻，gsk2基因编码区该位点的4个核苷酸序列“tcaa”，不能被限制性核酸内切酶taql-v2识别并剪切，由此可以快速和准确地区分中胚轴长度基因gsk2两种不同基因型。

9、一种检测水稻中胚轴长度的基因gsk2等位基因的引物，其核苷酸序列包括gsk2-f和gsk2-r。更优选的，其核苷酸序列如gsk2-f和gsk2-r所示。

10、seq id no.1(gsk2-f)：5’-gggtggagtggagaaaca-3’

11、seq id no.2(gsk2-r)：5’-tcaccttcatgtgaacttc-3’

12、这种引物可以用于扩增和检测上述新的分子标记gsk2(taql-v2)或者扩增和检测水稻中胚轴基因gsk2。

13、一种鉴定水稻中胚轴长度的方法，检测纯合子水稻中胚轴长度基因gsk2等位基因的第3319位碱基的g/a多态性，gsk23319a基因型水稻具有较长的中胚轴长度，gsk23319g基因型水稻的中胚轴较短。

14、检测水稻中胚轴长度基因gsk2等位基因的方法，包括如下步骤：

15、(1)提取水稻基因组dna作为模板(可采用ctab法)，加入上述2种引物进行pcr扩增；

16、(2)pcr产物用taql-v2进行酶切反应；

17、(3)取酶切产物用凝胶电泳检测。

18、72℃优选的，步骤(1)中，pcr扩增程序为：93～95℃预变性4～7min；93～95℃变性42～50s、51～54℃退火42～50s、70～73℃延伸25～35s，共30～35个循环；最后70～73℃延伸9～12min。更优选的，pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、延伸45s，共36个循环；最后延伸5min。

19、优选的，步骤(3)中，在2.5～3.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测；更优选用3％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

20、测结果显示，含有gsk23319g对应相对较短中胚轴长度水稻均含有分子量分别约为537bp和117bp的两条带，而含有gsk23319a中对应相对较长中胚轴长度的水稻含有分子量约为654bp的条带。上述方法可用于筛选鉴定分别含有gsk23319g的基因型水稻与含有gsk23319a的基因型水稻杂交后代，以及分别含有gsk23319g的基因型水稻与含有gsk23319a、的基因型水稻自交后代，或者分别含有gsk23319g的基因型水稻与含有gsk23319a的基因型水稻回交的后代。所检测的水稻为含有gsk23319g的基因型水稻、含有gsk23319a的基因型水稻、含有gsk23319g的基因型水稻与含有gsk23319a的基因型水稻的杂交后代及其再自交或回交后代。

21、如模板总dna由纯合含有gsk23319g的水稻基因型水稻提取，酶切后的产物均含有分子量分别约为537bp和117bp的两种条带。如模板含有gsk23319a的基因型水稻提取，酶切后的产物均含有分子量约为654bp的条带。

22、如模板总dna由含有gsk23319g的基因型水稻与含有gsk23319a的基因型水稻杂交后代的杂合子水稻提取，酶切后的产物均含有分子量约为654bp、537bp和117bp的三种条带。

23、如模板总dna由含有gsk23319g的基因型水稻与含有gsk23319a的基因型水稻杂交f1植株再自交的后代水稻提取，不同植株酶切后的产物应该有三种类型的带型：对于纯合型含有gsk23319g的基因型水稻含有分子量约为537bp和117bp两种条带；对于杂合子含有分子量约为654bp、537bp和117bp三种条带；对于纯合型含有gsk23319a的基因型水稻含有分子量约为654bp一种条带。

24、如模板总dna由含有gsk23319g的基因型水稻与含有gsk23319a的基因型水稻杂交f1植株再与含有gsk23319a的基因型水稻回交的后代水稻提取，不同植株酶切后的产物应该有两种类型的带型：含有gsk23319a基因型水稻含有分子量约为654bp一种条带；杂合子含有分子量约为654bp、537bp和117bp三种条带。

25、通过上述方法可用于鉴别对应相对较长中胚轴长度gsk23319a的基因型水稻、对应相对较短中胚轴长度gsk23319g的基因型水稻以及gsk23319a基因型水稻与gsk23319g基因型水稻杂交后代水稻以及杂交并自交或杂交并回交后代水稻。

26、优选的，gsk23319a基因型水稻与gsk23319g基因型水稻杂交品种，其亲本含有gsk23319a的基因型水稻，上述方法检测后只显示一条654bp条带的对应相对较长中胚轴长度gsk23319a基因型的水稻。所述的水稻包括但不限于：“松香稻1号”、“上师大19号”、“嘉禾218”、“dell香稻”、“香稻1号”。

27、本发明提供了一种针对水稻中胚轴基因gsk2 3435bp处g/a变异的选择性分子标记，对选育含有gsk23319a基因型对应相对较长中胚轴长度的水稻非常有实用价值。

28、采用本发明的方案，通过鉴定gsk2等位基因型的分子标记，从而检测gsk2的基因型，对回交后代进行检测，选取杂合植株继续与对应相对较长中胚轴长度的gsk23319a基因型水稻回交。因此，对于作为鉴定中胚轴基因型的分子标记位点，能够区分作为亲本的gsk23319g基因型水稻和gsk23319a基因型水稻。

29、对于水稻中胚轴基因gsk2编码区3319bp位点是否是腺嘌呤脱氧核苷酸(a)的鉴定，可确定在使用本发明的中胚轴基因gsk2分子标记gsk2(taql-v2)进行新的对应相对较长中胚轴长度的新品种培育的辅助筛选时，有哪些对应相对较长中胚轴长度水稻品种适合被选作亲本，可用于辅助常规育种快速、简便、准确选育较长中胚轴长度的水稻。

30、本发明的有益效果在于，根据gsk2等位基因的第3319位碱基的g/a多态性可以调控中胚轴长度，可以通过检测gsk23319g等位基因型和gsk23319a等位基因型，快速鉴定水稻中胚轴长度。

31、本发明所提供gsk2(taql-v2)分子标记及其检测引物和检测方法操作简便，结果容易判断。采用本发明方案对gsk23319a等位基因和gsk23319g等位基因进行检测，只需要使用3％左右琼脂糖凝胶就能很容易分辨，不但可以快速、方便地鉴定对应相对较长中胚轴长度的水稻与对应相对较短中胚轴长度的水稻，还可以快速鉴定杂交、回交、自交子代中的gsk23319a基因型和gsk23319g基因型，对拥有对应相对较长中胚轴水稻培育和筛选有重要的应用价值。