一种基于茄子斑驳矮化病毒的植物基因编辑系统的制作方法

本发明涉及植物基因工程和病毒分子生物学，特别涉及一种基于茄子斑驳矮化病毒的植物基因编辑系统。

背景技术：

1、crispr/cas9系统被广泛应用于包括植物的各种生物的基因组编辑。该系统由cas9核酸酶和向导rna(或称为grna)组成，cas9通过grna提供的20nt间隔序列特异的与靶基因结合，从而切割含有特定原间隔邻近基序(pam)靶dna，产生dna双链断裂(dsb)，后者在细胞非同源末端连接(nhej)dna修复途径的作用下重新连接，并可在连接位点造成一个多或多个碱基的缺失或插入。

2、crispr/cas9基因编辑系统在植物中主要诱导产生1-3碱基对(bp)的缺失和单碱基的插入，当发生在编码区时这类突变容易引起移码突变，从而导致相关功能丧失。然而，由于单个rna引导的cas9编辑无法产生更长的缺失，所以当编辑非编码dna序列时仍然是一个挑战。尤其是在没有事先了解核心元件的情况下，单个grna诱导的非编码区少数碱基的突变较不容易产生功能缺失突变。

3、内切核酸酶可降解双链断裂dna的游离末端，有助于实现较大dna序列片段的缺失。人类trex2外切酶和噬菌体t5外切酶都具有5'到3'方向上消化双链dna(dsdna)的活性，并产生更长的缺失突变类型。

4、植物基因编辑通常依赖于转基因方法在植物细胞内表达crispr/cas核酸酶。目前虽有报道少数植物病毒载体可用于瞬时表达crispr/cas核酸酶并对植物基因进行编辑，但大多数植物病毒载体对外源基因片段的承载能力有限，无法表达完整的crispr/cas核酸酶。因此，开发高效的病毒载体递送载体，实现对植物特定基因组序列的有效缺失突变是有必要的。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种基于茄子斑驳矮化病毒的植物基因编辑系统，。

2、本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

3、一种基于茄子斑驳矮化病毒的植物基因编辑系统，包括：

4、a)一个茄子斑驳矮化病毒(emdv)载体；

5、b)一个引入的异源的核酸序列转录单元被插入茄子斑驳矮化病毒载体基因组中，用于表达序列特异性cas9核酸酶和外切核酸酶融合蛋白；

6、c)另一个引入的异源的核酸序列转录单元被插入茄子斑驳矮化病毒载体基因组中，用于表达crispr向导rna(grna)；

7、其中，所述茄子矮化斑驳病毒侵染植物瞬时表达异源序列，所述cas9核酸酶由向导rna引导切割植物特定基因组dna序列，所述外切核酸酶进一步消化dna末端产生序列缺失。

8、优选地，所述茄子矮化斑驳病毒序列如seq id no:1所示。

9、优选地，所述异源核酸序列转录单元插入于茄子斑驳矮化病毒载体的n-x基因间隔区。

10、优选地，所述融合蛋白为cas9核酸酶羧基端与外切核酸酶通过一段linker序列连接形成，所述的linker序列如seq id no:5所示；所述cas9核酸酶为化脓链球菌(streptococcus pyogenes)核酸酶spcas9，序列如seq id no:2所示；所述外切核酸酶为trex2或t5外切酶，序列如seq id no:4和seq id no:3所示。

11、优选地，所述向导rna两端分别含有trna序列如seq id no:9所示。

12、优选地，所述序列缺失包括一个至多个碱基的缺失。

13、优选地，包含所述emdv的重组表达载体为表达cas9核酸酶与grna的重组emdv载体(pemdv-pdsa-cas9)、表达cas9核酸酶和trex2外切酶融合蛋白与grna的重组emdv载体(pemdv-pdsa-cas9-trex2)或表达cas9核酸酶和t5外切酶融合蛋白与grna的重组emdv载体(pemdv-pdsa-cas9-t5)，pdsa为本氏烟pds-a基因。

14、优选地，所述包含emdv的重组表达载体通过以下方法构建：

15、(1)线性化载体：以emdv-wt、pemdv-pdsa-cas9-t5或pemdv-pdsa-cas9-trex2为骨架载体，bstbi与avrii双酶切后凝胶回收得到线性化载体emdv-cas9 backbone；

16、(2)插入片段1：将pgd-pdsa-cas9、pgd-pdsa-cas9-t5或pgd-pdsa-cas9-trex2中间载体，bstbi与avrii双酶切后凝胶回收得到对应插入片段pgd-pdsa-cas9-ⅰ、pgd-pdsa-cas9-t5-ⅰ或pgd-pdsa-cas9-trex2-ⅰ；

17、(3)t4连接：利用t4 dna ligase连接以上载体与片段，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，鉴定无误后即获得克隆pemdv-pdsa-cas9、pemdv-pdsa-cas9-t5或pemdv-pdsa-cas9-trex2。

18、一种基于茄子斑驳矮化病毒的植物基因编辑系统在植物进行基因编辑中的应用。

19、优选地，所述应用为利用侵染性emdv载体瞬时表达基因编辑元件对植物基因组特定序列进行缺失突变实现靶标基因片段缺失。

20、emdv基因组编码7个蛋白，顺序为3′-n-x-p-y-m-g-l-5′，包括5个结构蛋白，即核衣壳蛋白(nucleocapsid,n)、磷酸化蛋白(phosphoprotein,p)、基质蛋白(matrixprotein,m)、糖蛋白(glycoprotein,g)和rna聚合酶大亚基(large subunit ofpolymerase,l)，以及一个功能未知的x蛋白和一个推测的运动蛋白y。n蛋白、p蛋白和l蛋白与基因组rna紧密结合，组成核糖核蛋白核心复合物(rnp)，为病毒的最小侵染单元。rnp被m蛋白包裹，而m蛋白外层被外膜包裹，外膜主要由来源于寄主细胞的脂膜和穿插分散在脂膜中的g蛋白组成。

21、emdv基因组的两端分别包含3'-leader和5'-trailer序列，leader和trailer序列均为非蛋白编码序列，但对于emdv的基因组复制和mrna转录起着重要的调控作用。在转录过程中，以病毒基因组rna(vrna)为模板，从3'端开始依次转录出leader mrna和6条编码病毒蛋白的mrna，leader mrna不编码蛋白，7条编码mrna从基因组的3’端到5’端依次进行转录，且转录量从n到l逐渐递减。基因组rna的复制首先以vrna为模板合成与其完全互补的正义链基因组rna(crna)，crna与n、p及l三个核心蛋白结合形成包含crna的crnp，后者作为复制模板用于合成vrna。vrna衣壳化后形成vrnp，vrnp通过与m蛋白和g蛋白相互作用，进一步组装成完整的病毒颗粒。

22、emdv重组病毒表达载体构建是在emdv侵染性克隆的基础上进行的。作物一种负链rna病毒，emdv侵染性克隆组合物包括三类质粒载体：1)含有全长基因组cdna的转录载体；2)组成rnp的核心蛋白表达载体；3)来自其他病毒的rna沉默抑制子表达载体。

23、在本发明中，所述的基因组cdna的转录载体农杆菌双元表达载体，包含编码emdv反基因组rna的序列被可操作地连接于植物启动子，所述的启动子为来源于花椰菜花叶病毒的35s启动子。35s启动子被合适设计从病毒cdna的5′末端精确起始转录，而cdna3′末端融合了可自我剪切的丁型肝炎病毒核酶序列，用于精确加工病毒rna的3′末端。

24、在本发明中，所述的rnp的核心蛋白表达载体为一个或多个农杆菌双元表达载体，包含emdv n、p和l蛋白的编码序列如seq id no:6、7、8所示被可操作地连接于植物启动子。

25、在本发明中，所述的其他病毒的rna沉默抑制子表达载体为一个或多个农杆菌双元表达载体，包含番茄丛矮病毒p19蛋白、烟草蚀纹病毒hc-pro蛋白、大麦条纹花叶病毒γb蛋白的编码序列被可操作地连接于植物启动子。

26、当上述病毒侵染性克隆组合物共同导入植物细胞后，所述的cdna的转录载体产生病毒基因组rna；所述的核心蛋白表达载体产生rnp核心蛋白，包裹病毒rna形成核衣壳侵染单元；所述的rna沉默抑制子抑制植物的rna沉默反应，提高上述组份的表达水平，促进重组病毒的产生和侵染。

27、emdv的模块化基因组结构为病毒载体构建提供了便利，异源编码序列可设计为单独的转入单元插入病毒基因组cdna克隆中，利用病毒基因间隔区内包含的转录调控顺式元件指导异源mrna的转录合成。

28、在本发明中，所述的异源序列转录单元插入于emdv载体的n-x基因间隔区，包含重复的病毒n-x基因间隔区和异源核酸序列组成的编码区。其中，所述异源核酸序列分别编码grna和cas蛋白与外源核酸酶融合蛋白。本领域技术人员应理解，所述的异源序列转录单元可以被插入于emdv其它基因间隔区，如leader-n、x-p、p-y、y-m、m-g、g-l、l-trailer外。

29、在本发明中，所述的向导rna两侧含有trna序列。emdv的复制和mrna转录发生与细胞质中，所述的trna融合序列可被细胞核trna加工机器识别并剪除，从而精确释放内部的向导rna分子。

30、另一方面，本发明进一步提供了一种利用重组病毒载体瞬时表达基因编辑元件对植物基因组特定序列进行缺失突变的方法，该方法无需在待修饰的植物细胞基因组内引入外源dna，其步骤包括：a)提供至少一个遗传物质待修饰的植物细胞；b)利用重组emdv载体侵染所述的植物细胞并瞬时表达所述的基因编辑元件；c)所述的基因编辑元件对植物基因组中特定的靶序列产生缺失突变。

31、在本发明中，所述茄子emdv在侵染的植物细胞内瞬时表达cas蛋白和外切核酸酶的融合蛋白，以及向导rna。其中，所述cas9核酸酶由向导rna引导切割植物特定基因组dna序列，所述的外切核酸酶进一步消化dna末端产生序列缺失。外切核酸酶为trex2核酸酶或外切核酸酶为t5核酸酶。

32、在本发明中，所述的向导rna靶向植物pds基因，所述的靶序列缺失突变包含至少一个或多个碱基的缺失，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个及以上等。

33、在本发明的一些实施例中，所述的重组emdv载体为侵染性病毒载体；所述的植物为本氏烟(nicotiana benthamiana)。emdv可侵染植物寄主还包括普通烟(nicotianatabacum)、茄子(solanum melongena l.)、辣椒(capsicum annuum l.)和马铃薯(solanumtuberosum l.)等。

34、在本发明中，所述的重组emdv侵染植物细胞的方法为农杆菌接种侵染植物，即将包含emdv重组病毒载体与辅助质粒载体的农杆菌菌株以合适的比例混合后浸润本氏烟叶片产生重组病毒，后者侵染植株组织并表达基因编辑元件。本领域技术人员容易设想的是，该重组病毒载体可以通过其他方式侵染植物，包括但不限于汁液摩擦接种、植株嫁接、介体昆虫传播。

35、本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

36、(1)所述emdv在侵染的烟草组织中可高效稳定地表达cas9-trex2和cas9-t5融合蛋白及向导rna；

37、(2)利用本发明提供的重组病毒表达载体能在烟草中实现基因较大片段的缺失，有助于删除植物基因组编码区和非编码区的特定序列元件；

38、(3)所述的emdv载体为侵染性rna病毒载体，无需在待修饰的细胞中引入外源dna序列，无外源基因整合的风险。