一种以类甜蛋白基因为靶序列的食品中玉米成分的LMTIA检测方法及其应用

本发明属于分子生物学核酸检测，具体涉及一种以类甜蛋白基因为靶序列的食品中玉米成分的lmtia检测方法、引物组、试剂盒与应用。

背景技术：

1、dna具有较高的遗传稳定性，不同的油料植物含有不同的特异性dna，基于dna的检测方法已经成为食品真实性鉴别中物种源性成分鉴定最主要也是最有效的技术。

2、食用油中dna提取与检测的难题在于，对于大多数植物油，物理或化学精炼过程可以去除不受欢迎的颜色和气味，但是在精炼过程应用的热处理技术及活性粘土可能会破坏dna的完整性。另一个需要克服的问题就是食用油中dna含量极少。食用油中常用的dna提取技术可以分为两大类，试剂盒法和改良法。我国食用油以大豆油、菜籽油等为主，制备工艺复杂，dna易被破坏，研究人员主要使用一些改良的方法。

3、在食用油dna提取上，国内学者已经做了很多研究。早在2002年，谭文等就成功建立了食用油dna提取方法，其后期研究表明花生油在提取dna之前需要进行热处理，并且能用于定性定量pcr检测。金红等人发现，在dna提取时充分乳化、延长dna沉淀时间，并且多次富集，可以提取出可扩增的食用油dna，成功检测到了大豆色拉油中转基因成分。白立群等建立的冷冻干燥法提取食用油dna，也可检测到大豆内源基因和外源基因。张娟以ctab法为基础，对dna提取方法改良，直接使用精炼植物油提取减少了dna损失，但是外源基因无法完成扩增。刘锦鹤在食用油dna提取中采用了硅膜吸附柱法，而后用pcr和lamp检测，都成功地检测出了植物油中的内源基因lectin、hmgi/y及外源基因camv35s启动子，为植物油的基因检测奠定了基础。王贝贝等以芝麻油为原料优化dna树脂提取法，研究结果表明摇匀速度对提取dna浓度影响效果显著。su等采用非二氧化硅二极纳米复合物提取食用油dna，可实现实时pcr的扩增，检测两到三种混合植物油的产地及比例。最新研究，游尚奇等使用改良ctab法和商用试剂盒提取6种食用植物油的dna，采用的两种改良ctab法仅在裂解液成分和比例上存在差异。结果表明，加入了2％(v/v)2-巯基乙醇的改良ctab法2提取效果最好，可用于后续食用油检测。段玉珠等将基于ctab的商业试剂盒法与核酸富集相结合，通过pcr同样能够可靠有效的追踪精炼植物油。

4、外国科学家专注于从橄榄油中提取dna，因为橄榄油在他们国家和地区被广泛使用。橄榄油制取工艺简单，少量的油便可提取质量优良的dna。经报道，效果较好的食用油dna提取试剂盒有nucleospin food、wizardmagnetic dnapurification system forfood、qiaamp dna stool，而nucleospin方法被证实是唯一一种能够从精炼植物油中提取可扩增dna的方法。sonia等通过评估裂解缓冲液中有机化合物和几种组分的影响以及裂解和沉降时间，优化了ctab法，比传统的dna提取方法耗时更短，可以从精制植物油中提取可扩增的dna。macherey-nagel柱可根据dna对硅胶的亲和力，通过色谱法分离dna，lucchetti等基于此方法提取的榛子油可用于ssr分析。

5、食用油在加工过程中要进行脱胶、脱臭和脱色处理，dna受到严重破坏。食用油中dna的提取技术是是限制食用油核酸检测的关键。

6、等温扩增技术已经被广泛用于食品掺假检测中，然而在食用油的检测方面的应用还较少，但是这种方法已经被证实是可行的。梯型熔解温度等温扩增(ladder-shapemeltingtemperature isothermalamplification,lmtia)技术是王德国等在lamp技术和pcr技术的基础上开发的一种新型等温扩增技术，该技术不需要热变性也不需要复杂的酶体系，反应时间短，对靶序列长度要求低，具有广阔的应用前景。lmtia技术既可以扩增dna又可以扩增rna，构建了食品中植物源成分检测的内标方法。建立了红薯粉条中木薯成分lmtia检测方法，食用油中大豆源成分的lmtia检测方法，乳制品中大豆源成分的lmtia检测方法等，但还缺乏食用油中玉米源成分的检测方法。

7、因此，亟需一种食品中玉米源成分的监测方法，为食品中玉米成分的鉴定提供技术支撑，为食品及食用油等掺假造假提供检测手段。

技术实现思路

1、为了更好的解决上述问题，本发明采用最新的lmtia技术(技术原理详见cn2020111054053或pct/cn2020/133584)设计lmtia引物，并建立玉米成分的快速检测方法，为食品中玉米成分的鉴定提供技术支撑，可用于检测食品中是否含有玉米源成分及食用油中是否含玉米油，为食用油及食品等掺假造假提供检测手段。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种用于食品中玉米成分检测的lmtia引物组，引物组以玉米类甜蛋白为靶序列，引物组的序列为：

4、2f3：5’-cccgccaacctcgagctttttcgtgctatgttgtttgttgcc-3’

5、2b3：5’-ggcggggaacacgggttttttctctgagaccatgccagg-3’

6、2lf3：5’-ccacgcatgaacaaacagt-3’。

7、根据本发明实施例的第二方面，本发明提供一种用于食品中玉米成分检测的试剂盒，试剂盒包括权利要求1的lmtia引物组。

8、根据本发明实施例的第三方面，本发明提供一种根据上述第一方案的lmtia引物组或上述第二方面的试剂盒在食品中玉米成分检测中的应用。

9、根据本发明实施例的第四方面，本发明提供一种以类甜蛋白基因为靶序列的食品中玉米成分的lmtia检测方法，取待测样品，抽提样品dna，采用上述第一方案的lmtia引物组或上述第二方面的试剂盒配制lmtia反应体系，并将配制好的lmtia反应体系置于实时荧光定量pcr系统中进行等温扩增以检测样品中是否含有玉米成分；若扩增结果图中出现指数曲线，则样品中含有玉米成分；若扩增结果中没有出现扩增曲线，则样品中不含有玉米成分。

10、作为进一步优选的技术方案，lmtia反应体系中2f3:2b3:2lf3的摩尔比为2:2:1。

11、作为进一步优选的技术方案，lmtia反应体系为10μl，组成为：1.3μmol的引物2f3、1.3μmol的引物2b3、0.65μmol的环引物2lf3，3.94μl通用型lmtia反应预混液、2μl玉米基因组dna，ddh2o补充至10μl。

12、作为进一步优选的技术方案，所述等温扩增的温度为58℃，等温扩增的时间为20分钟。

13、本发明的有益效果是：

14、本发明的用于检测玉米成分的lmtia引物组、试剂盒具有良好的特异性和灵敏度，检测速度快，在恒温条件下即可实现对样品中玉米成分的检测。

15、本发明的食品中玉米成分的lmtia检测的方法简单、快捷，在等温条件下恒温扩增20min即可实现样品中植物源成分的精准检测，并具有较好的重复性和较高的稳定性。

16、本发明的lmtia引物组在58℃时特异性更好。

17、本发明的lmtia引物组的绝对灵敏度可达100pg/μl。

18、本发明的lmtia引物组可利用等温扩增技术对玉米基因片段进行扩增，用于检测所抽取的食品以及食用油中的dna，对市场上食品及食用油是否掺假进行有效且快速的检测。