一种用于检测弓首蛔虫感染的miRNA标志物、引物、试剂盒及应用

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种用于检测弓首蛔虫感染的mirna标志物、引物、试剂盒及应用。

背景技术：

1、弓首蛔虫是一种常见于犬、猫的消化道寄生线虫，可简单基于粪便中乳白色虫体或粪便学检查虫卵进行诊断。弓首蛔虫可以感染人及多种动物，幼虫经历肝-肺移行和神经-肌肉移行阶段，但是不发育为成虫，因此无法通过粪便学检查虫卵进行诊断。目前，人感染弓首蛔虫主要基于特异性igg抗体的elis a检测。例如，toxocara igg elisa kit(abnova，ka4856)、toxocara ig g(ridascreen，k7421)等产品用于定性检测宿主血清样本中弓首蛔虫属igg抗体。而elisa检测的缺点是无法区分患病与既往感染。此外，肝-肺移行期弓首蛔虫可通过肝、肺部组织活检(pcr扩增弓首蛔虫的特异性dna片段)进行检测，但目前只应用于实验室检测尤其是科学研究，无具体商品化产品。

2、microrna(mirna)是一类长度约为18-24个核苷酸的高度保守非编码r na，在外泌体中以稳定的形式存在于多种体液(包括血液、唾液和尿液)，是一类新型的病原/疾病特异性潜在标志物。由于具有病原/组织特异性、稳定性、可定量的特点，理论上mirna可以用于检测不同的疾病类型，甚至可以用于疾病分期(参考文献：d'aiuto,f et al.“mir-30e*isan independent s ubtype-specific prognostic marker in breast cancer.”britishjournal of cancer v ol.113,2(2015):290-8.doi:10.1038/bjc.2015.206)。例如，通过qrt-pcr定量检测mir-199a-5p在区分乳腺癌疾病阶段和肿瘤亚型时表现出极高的特异性和灵敏度(参考文献：shin,v y et al.“circulating cell-free mirnas as bi omarkerfor triple-negative breast cancer.”british journal of cancer vol.112,11(2015):1751-9.doi:10.1038/bjc.2015.143)。

3、弓首蛔虫可以感染人，幼虫经历肝-肺移行和神经-肌肉移行阶段，但是不发育为成虫、交配产卵，因此无法通过粪便学检查进行诊断。目前，包括人在内的非特异性宿主是否感染弓首蛔虫主要基于特异性igg抗体的elisa检测，但是无法区分患病与既往感染；肺部组织活检(pcr扩增弓首蛔虫的特异性d na片段)可以用于确诊，但是侵入性大、漏检率高且不实用。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明旨在发现新的弓首蛔虫肝-肺移行期弓首蛔虫外泌体mirna靶标分子，并针对性的设计用于检测该靶标分子的引物及试剂盒，以实现快速、高效的检测弓首蛔虫感染。

2、一方面，本技术提供了一种用于检测弓首蛔虫感染的mirna标志物，所述mirna标志物选自具有如下碱基序列的mirna1、mirna2中的至少任意一种：

3、mirna1：5’-uuuugauuguugcucagaga-3’；

4、mirna2：5’-auuuaaugcucugguacaua-3’。

5、在一种实施方式中，所述mirna标志物为mirna1和mirna2的组合。

6、优选的，本技术提供了一种用于检测弓首蛔虫感染的mirna标志物组合，所述mirna标志物组合为具有如下碱基序列的mirna1和mirna2：

7、mirna1：5’-uuuugauuguugcucagaga-3’；

8、mirna2：5’-auuuaaugcucugguacaua-3’。

9、另一方面，本技术提供了一种用于特异性检测所述的mirna标志物的引物，所述引物包括逆转录茎环引物和特异性上游引物，

10、所述逆转录茎环引物：

11、5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgact ctctg-3’；

12、5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgact atgta-3’；

13、所述上游特异性引物：

14、5’-gcgcgttttgattgttgct-3’，

15、5’-gcgcgatttaatgctctgg-3’。

16、优选的，标志物mirna1的逆转录茎环引物为：5’-gtcgtatccagtg cagggtccgaggtattcgcactggatacgactctctg-3’，上游特异性引物为：5’-gcgcgttttgattgttgct-3’；标志物mirna2的逆转录茎环引物为：5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactatgta-3’，上游特异性引物为：5’-gcgcgatttaatgctctgg-3’。

17、另一方面，本技术提供了一种试剂，所述试剂用于检测所述mirna标志物。

18、在一种实施方式中，所述试剂包括所述逆转录茎环引物和所述上游特异性引物。

19、另一方面，本技术提供了所述的mirna标志物，或所述的引物在制备弓首蛔虫感染检测试剂中的应用，所述试剂通过检测患者生物样品中的所述mi rna标志物的含量判定是否感染弓首蛔虫。

20、在一种实施方式中，所述试剂用于检测肝-肺移行期的弓首蛔虫感染。

21、在一种实施方式中，所述生物样品包括血液。

22、另一方面，本技术提供了一种用于检测弓首蛔虫感染的试剂盒，所述试剂盒包含用于特异性检测所述mirna标志物的试剂，或所述的引物。

23、另一方面，本技术提供了所述的mirna标志物，或所述的引物，或所述的试剂盒在制备检测弓首蛔虫感染的产品中的应用。

24、另一方面，本技术提供了一种检测弓首蛔虫感染的装置，所述装置包括：

25、样品扩增模块：提取待测样本的血浆mirna，使用如权利要求7所述的试剂盒进行处理，再进行实时荧光定量反应，检测荧光信号；

26、结果分析模块：根据待测样本中的mirna1和mirna2检测结果，判定为弓首蛔虫感染阳性、阴性或需重测样本。

27、在一种实施方式中，所述装置判定的方法包括：

28、如果待测样本中mirna1和mirna2检测结果ct值均<35，判定为阳性；

29、如果待测样本中mirna1或mirna2检测结果ct值>35，则判定为疑似样本，应重新采集样本进行检测；

30、如果待测样本中mirna1和mirna2检测结果ct值均>35或无数值，此次结果判断为阴性。

31、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

32、1、本发明基于弓首蛔虫肝-肺移行过程中释放至宿主血液中的循环外泌体mirna，确定了特异性循环mirna分子标志物mirna1和mirna2，并针对mirna1和mirna2设计实时荧光定量pcr扩增引物，以实现通过从宿主血样中检测弓首蛔虫特异性外泌体mirna靶标分子，确定是否感染弓首蛔虫，并且还可以将两个mirna的检测结果进行相互验证，进一步提高了确认是否感染的准确性。

33、2、本发明克服了人弓首蛔虫感染无法进行粪便学检查、肝肺组织活检侵入性大、漏检率高等缺点，可以高特异性、高灵敏度地检测肝-肺移行期的弓首蛔虫病原。