一种表达重组胶原蛋白的甲醇诱导发酵工艺的制作方法

本发明涉及一种表达重组胶原蛋白的甲醇诱导发酵工艺，属于生物发酵。

背景技术：

1、胶原蛋白是人体组织器官的主要结构蛋白，主要作用是维护和支撑细胞、组织、器官的正常生理功能以及参与人体组织损伤修复。它广泛分布在细胞外基质中，是哺乳动物体内含量最高，分布最广的蛋白质，约占人体蛋白总量的三分之一。在胶原蛋白行业，重组胶原蛋白作为更优质、更安全的新型胶原蛋白材料，一直备受关注。

2、胶原蛋白的生产一般通过毕赤酵母发酵获得，但是在发酵过程中还存在一些问题。

3、毕赤酵母的适宜生长温度范围较广，一般在15℃至37℃之间。当温度低于15℃时，代谢活性减弱，影响物质的跨膜运输，使得细胞增殖变慢，生长周期延长，蛋白质的生物合成受到抑制；温度的升高可以促进酵母菌酶的活性，加快代谢速率，促进蛋白质的合成，尤其是重组蛋白的表达合成，然而过高的温度会导致酵母细胞膜的脂质熔化，影响细胞膜完整性，同时会使酵母菌酶的结构发生变化，导致酵母菌生长和代谢受到抑制。所以，现有毕赤酵母发酵工艺主要为常温或低温发酵，主要集中在28～30℃发酵。

4、毕赤酵母对高温敏感，在32℃以上生长则不利于蛋白质的生物合成，一般在45℃时就停止生命活动，致死温度一般在50～60℃。在进行外源蛋白质的分泌表达时，培养温度过高还会使新合成肽链的速率超过内质网的折叠与加工能力，导致未成熟或错误折叠蛋白在宿主菌的内质网中大量积累，诱发内质网压力，进而限制了外源蛋白的分泌表达量。内质网压力对细胞代谢稳态的破坏，也是菌体死亡速率升高的重要原因。

5、目前有一些发酵工艺初始培养温度为30～32℃，但又很快将发酵温度降至27～29℃，诱导时间仍需90～120h；28～30℃或者更低温进行发酵诱导周期普遍在120h以上，发酵周期长，目的蛋白表达量低，发酵成本高。同时，在低温发酵时，低温使得细胞内各种生物酶活受到抑制，降低了重组蛋白合成的效率，延长了细胞的生长周期，同时延长了发酵周期。

6、另外，高密度发酵培养的微生物，在生长过程中会产生并蓄积大量热量，而毕赤酵母甲醇诱导是一个高放热过程，所以现在大规模工业化生产过程中，一般是会通过冷却水降温的方式降低发酵体系的温度，减少高温对微生物细胞的影响，但是会增加能耗成本。所以，毕赤酵母高密度发酵表达重组蛋白时，提升发酵温度，可能带来更高的产量，但会影响细胞的状态；降低发酵温度，则会影响蛋白的产量，同时增加成本。而如何在发酵温度、蛋白质合成表达、细胞生长状态之间取得平衡或兼顾的方案是一个发酵工艺中极为重要的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，克服现有技术中存在的一些技术问题，本发明提供一种表达重组胶原蛋白的甲醇诱导发酵工艺，能在提高重组人源胶原蛋白发酵温度的同时，缩短发酵周期，降低生产成本。进一步的，本发明的工艺可以提高胶原蛋白产量，通过控制发酵温度32～34℃，发酵过程中加入0.1～1g/l的半胱氨酸，甲醇和海藻糖混合诱导，调节毕赤酵母菌的生长代谢速度，提高重组人源胶原蛋白的表达量，进一步提升重组人源胶原蛋白的生产水平。

2、为达到上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供一种表达重组胶原蛋白的甲醇诱导发酵工艺，所述工艺包括：

4、毕赤酵母发酵种子液接种到发酵培养基后开始发酵，培养至甲醇诱导阶段，甘油流加结束后，一次性加入半胱氨酸，然后流加甲醇和海藻糖，进行双碳源混合诱导。

5、其中，所述种子液由巴斯德毕赤酵母野生型菌株或经过改在的含有外源基因的重组工程菌株得到；进一步的所述毕赤酵母为表达重组ⅰ型胶原蛋白的毕赤酵母。

6、更优选的，所述毕赤酵母菌公开于公开号为cn110964099a的专利，并已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.17150，保藏日期：2019年1月10日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名：巴斯德毕赤酵母pichia pastoris。

7、所述培养基为毕赤酵母发酵培养基(bsm培养基)，其配方为：85％h3po4 26.7ml/l；caso4·2h2o 0.93g/l；k2so4 18.2g/l；mgso4·7h2o 14.9g/l；koh 4.13g/l；甘油40.0g/l；ptm1溶液4ml/l。

8、其中，本发明所述的发酵工艺中，所述发酵培养至甘油培养阶段，待发酵生长8-11h后，流加50％(w/v)甘油至od值为200-240时甘油流加结束。

9、所述发酵培养温度为32-34℃，优选为34℃；所述半胱氨酸加入量为0.1～1g/l，优选的，加入半胱氨酸0.1g/l；

10、所述双碳源混合诱导时溶氧控制在30％，诱导时间为70～80h。

11、所述甲醇和海藻糖溶液混合补料诱导体积比例为7-9:1-3；优选的，所述甲醇和海藻糖溶液混合补料诱导体积比例为9：1，所述海藻糖溶液浓度为50％。

12、本发明的有益效果：

13、本发明提出的发酵工艺，发酵过程中，将发酵温度提高到32～34℃，缩短了发酵时间，减少了发酵过程能源消耗。甘油流加结束后，一次性加入0.1～1g/l的半胱氨酸，同时诱导时进行甲醇和海藻糖双碳源混合诱导的方法，提高毕赤酵母细胞在高温下的耐受性。经过发酵工艺优化，重组人源胶原蛋白表达量提高了近10倍。使得重组人源胶原蛋白能够工业化生产，为企业创造了巨大的经济价值。

14、本发明输出的是一个以高温诱导为核心，配套在发酵过程中添加一定量的半胱氨酸，提高细胞活性。甲醇和海藻糖一定比例混合碳源诱导，海藻糖能在极端条件下保护细胞。使得胶原蛋白产量提高近10倍，同时缩短了发酵周期，生产成本大幅降低。

技术特征：

1.一种表达重组胶原蛋白的甲醇诱导发酵工艺，其特征在于，所述工艺包括：

2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述种子液由巴斯德毕赤酵母野生型菌株或经过改造的含有外源基因的重组工程菌株得到。

3.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于，所述毕赤酵母为表达重组ⅰ型胶原蛋白的毕赤酵母。

4.根据权利要求3所述的发酵工艺，其特征在于，所述毕赤酵母菌保藏编号cgmccno.17150。

5.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养基为毕赤酵母发酵培养基，其配方为：85％h3po4 26.7ml/l；caso4·2h2o 0.93g/l；k2so4 18.2g/l；mgso4·7h2o14.9g/l；koh 4.13g/l；甘油40.0g/l；ptm1溶液4ml/l。

6.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养至甘油培养阶段，待发酵生长8-11h后，流加50％(w/v)甘油至od值为200-240时甘油流加结束。

7.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养温度为32-34℃，所述半胱氨酸加入量为0.1～1g/l。

8.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述双碳源混合诱导时溶氧控制在30％，诱导时间为70～80h。

9.根据权利要求7所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵温度为34℃，所述加入半胱氨酸0.1g/l。

10.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述甲醇和海藻糖溶液混合补料诱导体积比例为7-9:1-3；优选的，所述甲醇和海藻糖溶液混合补料诱导体积比例为9：1，所述海藻糖溶液浓度为50％。

技术总结
本发明涉及一种表达重组胶原蛋白的甲醇诱导发酵工艺，属于生物发酵技术领域。本发明的发酵工艺在甲醇诱导阶段，流加半胱氨酸，甲醇和海藻糖混合诱导，在提高重组人源胶原蛋白发酵温度的同时，缩短发酵周期，降低生产成本；同时，本发明的工艺可以提高胶原蛋白产量，通过控制发酵温度32～34℃，调节毕赤酵母菌的生长代谢速度，缩短了发酵周期，提高了重组人源胶原蛋白的表达量，进一步提升重组人源胶原蛋白的生产水平。

技术研发人员：钱晨明,李佳佳,凡孝菊,徐园,殷同,储筠,王丽萍,刘小海,钱松
受保护的技术使用者：江苏创健医疗科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19