一种肝素六糖及其制备方法与应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种肝素六糖及其制备方法与应用。

背景技术：

1、这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。

2、肝素(heparin，hp)是一种属于糖胺聚糖(gag)家族的多糖，由艾杜糖醛酸(idoa)或葡糖醛酸(glca)与葡糖胺(glcn)通过1-4糖苷键连接形成的重复双糖单元构成，在糖醛酸残基上具有2-o硫酸化取代，在葡糖胺残基可有n-乙酰化或硫酸化取代，以及3-o/6-o硫酸化取代。近年来的研究表明，hp的结构特性允许其在体内与多种细胞因子(蛋白质)相互作用，通过激活或抑制相关通路中的某些细胞因子发挥一系列的生物学功能，对相关疾病产生治疗或抑制效果。但由于肝素和低分子肝素的结构具有微不均一性，对其各种生理活性的发挥会受到一定限制，如在抗肿瘤等其他疾病的治疗中应用时，会具有潜在的副作用(如出血)，同时结构不明确对其构效关系的机制研究也存在明显的问题，不利于其抗凝血以外活性的应用。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种肝素六糖及其制备方法与应用，同时提供hp6在抗病毒、抗肿瘤及抗阿尔兹海默症方面的应用。

2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

3、第一方面，本发明提供一种肝素六糖，其结构式为：

4、

5、第二方面，本发明提供所述肝素六糖的制备方法，包括如下步骤：

6、使用肝素酶i切割肝素分子glcns6s(1-4)idoa2s之间的糖苷键，使肝素分子降解为多组分的寡糖混合物；

7、使用凝胶渗透色谱柱(gpc)将肝素寡糖混合物分离为不同分子量区间的寡糖片段；

8、采用强阴离子交换柱(sax)分离六糖混合物制备得到肝素六糖；

9、将得到的肝素六糖脱盐即得hp6。

10、通过酶法降解得到的肝素寡糖在非还原端糖醛酸的c4和c5之间形成一个碳碳不饱和双键，能与其羧基取代基产生共轭，在232nm处有较强的紫外吸收，这为后续肝素寡糖的制备提供了检测条件。

11、在一些实施例中，使用肝素酶i特异性切割肝素分子glcns6s(1-4)idoa2s之间的糖苷键的具体操作为：将肝素钠加入酶解缓冲液中，使其充分溶解，加入肝素酶i，在30-40℃反应3-4小时，即可。

12、优选的，反应完毕后，将反应液煮沸，使酶失活，离心取上清液，冻干。

13、在一些实施例中，使用凝胶渗透色谱柱(gpc)将肝素寡糖混合物分离为不同分子量区间的寡糖片段的具体工艺条件为：

14、色谱柱：ge superdex tm peptide 10/300gl凝胶渗透色谱柱；

15、检测器：uv 232nm；

16、流动相：0.2m碳酸氢铵溶液(过0.22μm滤膜，排气)；

17、流速：0.4ml/min；

18、进样量：120μl。

19、在一些实施例中，采用强阴离子交换柱(sax)分离六糖混合物制备得到肝素六糖，其具体工艺条件为：

20、色谱柱：waterss5 sax样品浓度：20μg/μl；

21、上样体积：200μl；

22、流速：4ml/min；

23、流动相：a:高纯水，ph值为3.5(抽滤、脱气)；

24、b:2m nacl溶液，ph值为3.5(抽滤、脱气)；

25、检测器：uv 232nm；

26、p max：5mpa。

27、在一些实施例中，将得到的肝素六糖进行脱盐的工艺条件为：

28、色谱柱：sephadex g-10凝胶色谱柱；

29、样品浓度：100mg/ml；

30、上样体积：5ml；

31、流速：3ml/min；

32、流动相：高纯水；

33、检测器：uv 232nm；

34、p max：200psi。

35、第三方面，本发明提供所述肝素六糖在制备抗神经退行性疾病及其相关疾病治疗药物、抗hiv的治疗药物和/或抗肿瘤药物中的应用。

36、在一些实施例中，神经退行性疾病为老年痴呆症或帕金森症。

37、优选的，所述相关疾病为腺病毒。

38、在一些实施例中，所述肿瘤为前列腺癌或肝癌。

39、上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：

40、(1)本发明通过高效液相色谱分离纯化得到所需肝素六糖hp6。

41、(2)本发明制备得到的肝素六糖hp6生物学活性显著、细胞亲和性好、无细胞毒性。hp6的抗凝活性显著低于肝素钠标准品，基本不具备抗凝血活性，因此，在发挥抗肿瘤活性用药时没有出血风险。

1.一种肝素六糖，其特征在于：其结构式为：

2.权利要求1所述肝素六糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的肝素六糖的制备方法，其特征在于：使用肝素酶i特异性切割肝素分子glcns6s(1-4)idoa2s之间的糖苷键的具体操作为：将肝素钠加入酶解缓冲液中，使其充分溶解，加入肝素酶i，在30-40℃反应3-4小时，即可；

4.根据权利要求2所述的肝素六糖的制备方法，其特征在于：使用凝胶渗透色谱柱将肝素寡糖混合物分离为不同分子量区间的寡糖片段的具体工艺条件为：

5.根据权利要求2所述的肝素六糖的制备方法，其特征在于：采用强阴离子交换柱分离六糖混合物制备得到肝素六糖，其具体工艺条件为：

6.根据权利要求2所述的肝素六糖的制备方法，其特征在于：将得到的肝素六糖进行脱盐的工艺条件为：

7.权利要求1所述肝素六糖在制备抗神经退行性疾病及其相关疾病治疗药物、抗hiv的治疗药物和/或抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：神经退行性疾病为老年痴呆症或帕金森症。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述相关疾病为腺病毒。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为前列腺癌或肝癌。