本发明属于生物医药领域，具体涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途。
背景技术：
1、肺癌目前占世界癌症死因的第一位，是世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。对于肺癌的治疗门类众多，但肺癌的预后仍较差，总体治疗效果目前仍不理想。由于肺癌的早期诊断尚有困难，又缺乏有效的治疗方法，因此选择一种简单易行，成模时间短，成模率高的肺癌动物模型对更加深入探讨肺癌的致癌因素、发病机制以及制定有效的治疗手段及防治措施是十分必要的。
2、lewis肺癌已被广泛应用于许多重要的研究。lewis肺癌细胞株(llc)最早是从小鼠lewis肺癌中分离到的适应培养细胞克隆系。c57bl/6小鼠具有正常的免疫功能，价格低廉、耐受性强，模型成熟，常用于lewis细胞的肺癌转移建模型构建。llc细胞在c57bl/6小鼠体内保持高度致瘤性和肺转移性，llc细胞采用基因工程技术修饰后可表达荧光素酶或绿色荧光蛋白，达到肿瘤细胞在活体内可视化效果(bertram js,janik p.establishment ofa cloned line of lewis lung carcinoma cells adapted to cell culture[j].cancerlett，1980,11(1):63-73；zhu h,et al.a simple bioluminescence imaging method forstudying cancer cell growth and metastasis after subcutaneous injection oflewis lung carcinoma cells in syngeneic c57bl/6mice[j].react oxyg species(apex),2018,5(14):118-125)。
3、随着噬菌体展示技术的出现和基因工程抗体技术的发展，噬菌体抗体库技术成为一种制备单克隆抗体的新方法。目前大多数的噬菌体抗体库为免疫噬菌体库，通过免疫后动物体内的抗体水平提高，更有利于筛选到针对特异性抗原的抗体，对后续诊断及治疗效果更有优势(许静，张磊等，b3hm细胞免疫小鼠脾细胞scfv噬菌体展示文库的构建及表达，中国生物工程杂志，2007，27(7)：12～16)。
4、目前尚未见关于ll/2-luc2细胞免疫动物筛选出特异性单克隆抗体的报道。本发明利用噬菌体展示技术筛选出特异性靶向ll/2-luc2细胞的单克隆抗体，为获得特异性识别肿瘤细胞的抗体和进一步制备抗肿瘤药物提供基础。
技术实现思路
1、本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体特异性靶向ll/2-luc2肺癌细胞。利用基因工程的方法，在鼠源免疫噬菌体抗体库中淘选并鉴定出能特异性结合ll/2-luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段，以达到能有效、快速识别ll/2-luc2肺癌细胞的目的，为获得特异性靶向肿瘤细胞的单克隆抗体提供了思路和方法。
2、为实现本发明的目的提供了如下实施方案。
3、本发明的一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段包含重链可变区cdr和轻链可变区cdr，所述重链可变区cdr具有选自seq id no:1～11的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区cdr具有选自seq idno:12～26的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
4、在一具体实施方案中，本发明的一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区cdr为cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，所述轻链可变区cdr为cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有选自下列组的氨基酸序列：
5、1)cdr-h1具有如seq id no:1所示的氨基酸序列、cdr-h2具有如seq id no:4所示的氨基酸序列和cdr-h3具有如seq id no:8所示的氨基酸序列且cdr-l1具有如seq id no:12所示的氨基酸序列、cdr-l2具有如seq id no:16所示的氨基酸序列和cdr-l3具有如seqid no:21所示的氨基酸序列；
6、2)cdr-h1具有如seq id no:1所示的氨基酸序列、cdr-h2具有如seq id no:4所示的氨基酸序列和cdr-h3具有如seq id no:8所示的氨基酸序列且cdr-l1具有如seq id no:13所示的氨基酸序列、cdr-l2具有如seq id no:17所示的氨基酸序列和cdr-l3具有如seqid no:22所示的氨基酸序列；
7、3)cdr-h1具有如seq id no:2所示的氨基酸序列、cdr-h2具有如seq id no:5所示的氨基酸序列和cdr-h3具有如seq id no:9所示的氨基酸序列且cdr-l1具有如seq id no:14所示的氨基酸序列、cdr-l2具有如seq id no:18所示的氨基酸序列和cdr-l3具有如seqid no:23所示的氨基酸序列；
8、4)cdr-h1具有如seq id no:1所示的氨基酸序列、cdr-h2具有如seq id no:6所示的氨基酸序列和cdr-h3具有如seq id no:9所示的氨基酸序列且cdr-l1具有如seq id no:14所示的氨基酸序列、cdr-l2具有如seq id no:18所示的氨基酸序列和cdr-l3具有如seqid no:24所示的氨基酸序列；
9、5)cdr-h1具有如seq id no:1所示的氨基酸序列、cdr-h2具有如seq id no:4所示的氨基酸序列和cdr-h3具有如seq id no:8所示的氨基酸序列且cdr-l1具有如seq id no:15所示的氨基酸序列、cdr-l2具有如seq id no:19所示的氨基酸序列和cdr-l3具有如seqid no:25所示的氨基酸序列；
10、6)cdr-h1具有如seq id no:1所示的氨基酸序列、cdr-h2具有如seq id no:4所示的氨基酸序列和cdr-h3具有如seq id no:11所示的氨基酸序列且cdr-l1具有如seq idno:14所示的氨基酸序列、cdr-l2具有如seq id no:20所示的氨基酸序列和cdr-l3具有如seq id no:26所示的氨基酸序列；
11、7)cdr-h1具有如seq id no:3所示的氨基酸序列、cdr-h2具有如seq id no:7所示的氨基酸序列和cdr-h3具有如seq id no:10所示的氨基酸序列且cdr-l1具有如seq idno:12所示的氨基酸序列、cdr-l2具有如seq id no:16所示的氨基酸序列和cdr-l3具有如seq id no:21所示的氨基酸序列。
12、优选的，上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段具有选自如seq id no.27～33所示的氨基酸序列。
13、更优选的，上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有选自表1中的抗体编号为501、y003、y005、y008、y009、y010和ra001的序列。
14、本发明还提供了一种dna分子，该dna分子编码上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
15、本发明还提供了一种表达载体，含有上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重组载体，将i l-10信号肽-单克隆抗体的表达序列克隆到pcdna3.4载体的not1/xba1酶多克隆位点处。
16、本发明还提供了一种真核宿主细胞，插入上述的表达载体，并转化。
17、上述的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞为cho细胞。
18、术语：cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3分别代表重链互补决定区1、重链互补决定区2、重链互补决定区3；cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3分别代表轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3。
19、在另一具体实施方案中，本发明提供了一种靶向ll/2-luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含重链互补决定区1(cdr-h1)、重链互补决定区2(cdr-h2)、重链互补决定区3(cdr-h3)，以及轻链互补决定区1(cdr-l1)、轻链互补决定区2(cdr-l2)、轻链互补决定区3(cdr-l3)。所述重链可变区cdr的氨基酸序列如seq id no:1～11所示；所述轻链可变区cdr的氨基酸序列如seq id no:12～26所示。
20、优选的，在上述的另一具体实施方案中，本发明的靶向ll/2-luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段，其cdr的氨基酸序列选自下列组：
21、(1)cdr-h1的氨基酸序列为seq id no:1、cdr-h2的氨基酸序列为seq id no:4、cdr-h3的氨基酸序列为seq id no:8；cdr-l1的氨基酸序列为seq id no:12、cdr-l2的氨基酸序列为seq id no:16、cdr-l3的氨基酸序列为seq id no:21；
22、(2)cdr-h1的氨基酸序列为seq id no:1、cdr-h2的氨基酸序列为seq id no:4、cdr-h3的氨基酸序列为seq id no:8；cdr-l1的氨基酸序列为seq id no:13、cdr-l2的氨基酸序列为seq id no:17、cdr-l3的氨基酸序列为seq id no:22；
23、(3)cdr-h1的氨基酸序列为seq id no:2、cdr-h2的氨基酸序列为seq id no:5、cdr-h3的氨基酸序列为seq id no:9；cdr-l1的氨基酸序列为seq id no:14、cdr-l2的氨基酸序列为seq id no:18、cdr-l3的氨基酸序列为seq id no:23；
24、(4)cdr-h1的氨基酸序列为seq id no:1、cdr-h2的氨基酸序列为seq id no:6、cdr-h3的氨基酸序列为seq id no:9；cdr-l1的氨基酸序列为seq id no:14、cdr-l2的氨基酸序列为seq id no:18、cdr-l3的氨基酸序列为seq id no:24；
25、(5)cdr-h1的氨基酸序列为seq id no:1、cdr-h2的氨基酸序列为seq id no:4、cdr-h3的氨基酸序列为seq id no:8；cdr-l1的氨基酸序列为seq id no:15、cdr-l2的氨基酸序列为seq id no:19、cdr-l3的氨基酸序列为seq id no:25；
26、(6)cdr-h1的氨基酸序列为seq id no:1、cdr-h2的氨基酸序列为seq id no:4、cdr-h3的氨基酸序列为seq id no:11；cdr-l1的氨基酸序列为seq id no:14、cdr-l2的氨基酸序列为seq id no:20、cdr-l3的氨基酸序列为seq idno:26；
27、(7)cdr-h1的氨基酸序列为seq id no:3、cdr-h2的氨基酸序列为seq id no:7、cdr-h3的氨基酸序列为seq id no:10；cdr-l1的氨基酸序列为seq id no:12、cdr-l2的氨基酸序列为seq id no:16、cdr-l3的氨基酸序列为seq id no:21。
28、进一步，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段选自scfv氨基酸序列如seq idno：27～33任一所示的序列。
29、本发明提供了所述单克隆抗体或其抗原结合片段的scfv序列的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
30、第一步，噬菌体抗体文库的构建；
31、第二步，噬菌体抗体文库的淘筛；
32、第三步，阳性细胞ll/2-luc2富集成功后将其富集的phage菌液涂板，挑阳性单克隆噬菌体送测序公司测序，得到靶向ll/2-luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链、轻链可变区序列；
33、第四步，用获得的重链、轻链可变区序列组装成scfv序列表达出相应抗体。
34、优选的是，所述第一步中噬菌体抗体文库的构建包括：
35、(1)用指数生长期的lewis肺癌ll/2-luc2细胞，腹腔注射免疫6只6～8周龄的c57小鼠，雌雄各半，每只注射1x105个细胞，隔周注射一次，免疫3次后处死小鼠；
36、(2)取6只免疫小鼠脾脏提取rna；
37、(3)rna反转录为cdna，以其为模板pcr扩增vh(重链可变区)和vl(轻链可变区)，再拼接成scfv片段；
38、(4)将scfv片段电转进入噬菌体，并评估文库质量；
39、(5)收集抗体库噬菌体，建立scfv噬菌体抗体库原始文库。
40、本发明还提供一种编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的dna分子。
41、本发明提供了一种包含所述靶向ll/2-luc2细胞的单克隆抗体的重组载体，所述载体包括前述的dna分子；将il-10信号肽-单克隆抗体的表达序列克隆到pcdna3.4载体的not1/xba1酶多克隆位点处。
42、本发明提供了一种宿主细胞，它被上述表达载体转化。在一个较佳的实例中，该宿主细胞是cho细胞。
43、本发明提供了一种制备上述本发明的单克隆抗体的方法，该方法包括：
44、(1)提供一种表达载体，该表达载体含有编码上述本发明的单克隆抗体的核酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；
45、(2)用步骤(1)所述的表达载体转化宿主细胞；
46、(3)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤(2)所得的宿主细胞；
47、(4)分离纯化获得所述单克隆抗体。
48、所述单克隆抗体为独特型抗体，可以与ll/2-luc2细胞特异性结合。流式细胞仪检测结果显示，采用体外重组表达的含501抗体序列的嵌合抗体与ll/2-luc2阳性细胞结合率高达35.84％，而与阴性细胞结合率约3.36％；免疫细胞化学实验结果显示，该含501抗体序列的嵌合抗体与ll/2-luc2阳性细胞有强阳性结合，与阴性细胞几乎无结合，均说明所述嵌合抗体具有靶向ll/2-luc2细胞的特性。
49、结合上述的技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的靶向ll/2-luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段，为构建特异性靶向肿瘤细胞的基因工程抗体提供支持。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性靶向ll/2-luc2肺癌细胞，并抑制其生长，因此，具有抗肿瘤活性。