一种高产乙酸酯的克鲁维毕赤酵母菌株及其应用

本发明属于微生物领域，涉及一株从果园中得到的能高产乙酸酯类化合物的酵母菌及其应用。

背景技术：

1、传统发酵食品包括白酒、啤酒、葡萄酒、酱油、食醋等，发酵过程中网罗多种微生物，通过微生物产生的酶类如氧化还原酶、水解酶、异构化酶、裂解酶、转移酶等，使原料成分（碳水化合物、蛋白质、脂质及其他大分子营养物质）水解产生单糖、游离脂肪酸和游离氨基酸等初级代谢产物，并进一步代谢产生多种次级代谢风味化合物如乙酸、醇类、酯类、醛类等风味化合物。与风味形成有较强相关性的优势菌株大致可分为三大类：细菌、酵母菌和霉菌。酵母菌分为酿酒酵母属和非酿酒酵母属，其中酿酒酵母属是传统白酒、黄酒、果酒等各类发酵酒中产生乙醇的主要微生物，非酿酒酵母属多为调节风味物质的形成，近年来由于其更强的产香能力受到越来越多的关注。除了在传统发酵食品中的应用，非酿酒酵母还被应用于发酵饲料的生产，这些经非酿酒酵母发酵的饲料产品具有独特的风味和营养特性，能增加动物的采食量，有助于生产性能的改善。但是，大多数非酿酒酵母的发酵能力相对较差。

2、乙酸酯类化合物是多种发酵食品的特征发酵风味组成物质，丰富的乙酸酯类化合物可以使食品具有典型的酯香特征，从而构成食品体系的主要风味轮廓。例如葡萄酒的特征挥发性风味物质为：癸酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸己酯；啤酒的特征挥发性风味物质为：乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇；红曲黄酒的特征挥发性风味物质为：异丁醇、异戊醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯等；糯米酒中主要风味物质是乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、乙酸丁酯等；绍兴酒中甜、苦、鲜、涩等味的形成主要乙酸相关，主要含有的乙酸有乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等。

3、传统发酵产品的微生物来源正从依赖于自然状态下的菌落演替，走向人工控制，从而减少菌群的不确定性，实现标准化生产。现有研究中，对发酵食品/饲料中产酸和产酯酵母菌菌种的探索多集中在酿酒酵母，对非酿酒酵母的筛选和应用远远不够。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：提供一种高产乙酸苯乙酯克鲁维毕赤酵母菌株（ pichia  kluyveri）及其应用，从宁夏宁东采集的苹果梨生长的原生环境中筛选具有产香能力的非酿酒酵母，可作为食品/饲料发酵剂的菌种资源，以增加发酵产品中的乙酸酯类化合物含量及种类。

2、本发明提供一种可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母（ pichia kluyveri），其保藏编号为cgmcc no.27659。该菌株编号为pkl-a，已于2023年6月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），保藏单位地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为克鲁维毕赤酵母（ pichia  kluyveri）。

3、本发明也提供所述的可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母在制备乙酸酯类化合物中的应用。

4、进而提供一种制备乙酸酯类化合物的方法，其包括通过发酵所述的可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母以产生乙酸酯类化合物，以及收集所述乙酸酯类化合物的步骤。

5、具体地：发酵前活化所述克鲁维毕赤酵母，是将其接种于ypd培养基中，并于20-30℃培养12-20h，活化三代；所述ypd培养基：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，ph 7.0，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。

6、优选地，所述发酵中使用的培养基为：麦芽汁糖度8.8 brix，ph 5.5，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。

7、在具体实施方式中，发酵是将活化后的克鲁维毕赤酵母，接入发酵培养基中，培养温度25℃，厌氧发酵8-14d，ph值为5.5，发酵结束后，离心分离，取上清液收集其中的乙酸酯类化合物。

8、本发明还提供另一种制备乙酸酯类化合物的方法，其特征在于，其包括通过同时混合发酵或顺序发酵所述的可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母以产生乙酸酯类化合物，以及收集所述乙酸酯类化合物的步骤。

9、优选地，所述同时混合发酵是将所述克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母同时接入发酵培养基，无氧发酵8-14d，发酵结束后得到发酵菌液，离心后取上清收集其中的乙酸酯类化合物。

10、优选地，所述酿酒酵母是糖化酶酿酒酵母，例如原产地比利时的季节酵母（bellesaison），例如可购自拉曼酵母公司。

11、优选地，所述克鲁维毕赤酵母与酿酒酵母按照接种量10-30：1（更优选为20：1）的比例进行同时接种或顺序接种。

12、另外优选地，所述顺序发酵是指接种所述克鲁维毕赤酵母后1-5天再接入酿酒酵母，无氧发酵8-14d，发酵结束后得到发酵菌液，离心后取上清收集其中的乙酸酯类化合物。

13、优选地，所述发酵中使用的培养基为：麦芽汁糖度8.8 brix，ph 5.5，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。

14、其中，上述可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母/酿酒酵母混合发酵方案所产的挥发性香气物质包括乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、异戊醇。本发明采用这种方式主要考虑到，克鲁维毕赤酵母对于二糖、三糖的发酵能力无法与酿酒酵母相比，故特意将其与酿酒酵母混合发酵的方式以研究是能够赋予发酵产品独特香气特征，而研究结果表明效果十分突出。

15、本发明分离到的可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母可发酵葡萄糖、果糖和蔗糖，并产香。尤其所述克鲁维毕赤酵母与酿酒酵母同时或顺序接种的发酵方案所产的挥发性香气物质包括乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、异戊醇。在一个实验中，同时发酵方案中产乙酸酯类化合物的产量为：乙酸异戊酯7.603mg/l、乙酸苯乙酯1.323 mg/l。顺序接种发酵方案产乙酸酯类化合物的产量为：乙酸异戊酯13.032 mg/l、乙酸苯乙酯2.076 mg/l。因此，本发明菌株可应用于传统发酵食品及发酵饲料的生产，拓宽发酵食品/饲料中酵母菌种的选择种类，推动相关发酵产品的标准化工业生产。具有较大的应用价值。

技术特征：

1.可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母（pichia kluyveri），其特征在于：其保藏编号为cgmcc no.27659。

2.根据权利要求1所述的可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母在制备乙酸酯类化合物中的应用。

3.一种制备乙酸酯类化合物的方法，其特征在于，其包括通过发酵如权利要求1所述的可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母以产生乙酸酯类化合物，以及收集所述乙酸酯类化合物的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：发酵前活化所述克鲁维毕赤酵母，是将其接种于ypd培养基中，并于20-30℃培养12-20h，活化三代；所述ypd培养基：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，ph 7.0，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵中使用的培养基为：麦芽汁糖度8.8 brix，ph 5.5，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：发酵是将活化后的克鲁维毕赤酵母，接入发酵培养基中，培养温度25℃，厌氧发酵8-14d，ph值为5.5，发酵结束后，离心分离，取上清液收集其中的乙酸酯类化合物。

7.一种制备乙酸酯类化合物的方法，其特征在于：其包括通过同时混合发酵或顺序发酵如权利要求1所述的可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母以产生乙酸酯类化合物，以及收集所述乙酸酯类化合物的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述同时混合发酵是将所述克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母同时接入发酵培养基，无氧发酵8-14d，发酵结束后得到发酵菌液，离心后取上清收集其中的乙酸酯类化合物。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述克鲁维毕赤酵母与酿酒酵母按照接种量10-30：1的比例进行同时接种或顺序接种。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述顺序发酵是指接种所述克鲁维毕赤酵母后1-5天再接入酿酒酵母，无氧发酵8-14d，发酵结束后得到发酵菌液，离心后取上清收集其中的乙酸酯类化合物。

11.根据权利要求7至9任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵中使用的培养基为：麦芽汁糖度8.8 brix，ph 5.5，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。

12.根据权利要求7至9任一项所述的方法，其特征在于：所述乙酸酯类化合物是乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、异戊醇中的一种或多种。

技术总结
本发明公开了一种可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母及其应用，属于生物领域。本发明从果园果实表面筛选得到一种可产乙酸酯类化合物的克鲁维毕赤酵母，保藏编号为CGMCCNo.27659。本发明提供的菌株可产多种乙酸酯类化合物，可应用于传统发酵食品及发酵饲料的生产，拓宽发酵食品/饲料中酵母菌种的选择种类，推动相关发酵产品的标准化工业生产。

技术研发人员：吴信,洪凯,高乐
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15