一种马铃薯抗性小G蛋白基因StRab5b的克隆方法及应用

本发明涉及克隆，具体是一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab 5b的克隆方法及应用。

背景技术：

1、小g蛋白是一类单体gtp结合蛋白，具有gtpase活性，分子量介于21-30kd。依据功能的不同分为5个家族，即ras，rho，rab，arf和ran家族。现有研究证明，小g蛋白调控着许多种细胞生理过程，如基因表达、细胞壁合成、h2o2产生、内吞作用、胞外分泌、胞浆的移动、细胞周期、真核生物器官细胞分化等。rab蛋白是小g蛋白家族中最大的一个家族，广泛存在于动物、植物和微生物中，与其他小g蛋白具有很高的同源性。目前rab蛋白被证明能够参与植物生物胁迫和非生物胁迫的响应过程，参与植物激素介导的信号路径。

2、马铃薯晚疫病是由phytophthora infestans引起的毁灭性病害，每年给马铃薯生产带来重大损失，一般发生的年份可以造成10％～20％的减产，严重发生年份减产可达到50％～70％，甚至全部绝收，晚疫病已经成为限制马铃薯产业发展的重要因素。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab 5b的克隆方法及应用。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab 5b的克隆方法，包括以下步骤：

4、步骤一：收集叶片组织，提取总rna；

5、步骤二：检测rna的完整性；

6、步骤三：利用反转录试剂盒，将其反转录为cdna；

7、步骤四：以cdna为模板，用引物进行pcr扩增；

8、步骤五：pcr扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒纯化后，克隆到peasy-blunt cloning vector载体中，转化大肠杆菌dh5α后进行测序；

9、步骤六：利用软件dnaman软件进行序列分析，获得strab 5b基因orf全部序列，cdna全长为603bp，编码200个氨基酸。

10、优选地，所述步骤一中选用马铃薯品种底西瑞的组培苗，在ms固体培养基中生长40d后收集叶片组织。

11、优选地，所述步骤二中通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。

12、优选地，所述步骤二中用nano drop2000超微量分光光度计测定rna浓度。

13、优选地，所述步骤三中反转录试剂盒为hiscript 1st strand cdna synthesiskit。

14、优选地，所述步骤四中引物为strab5b-f：5′atgggttgcgcatcttcagc-3′和strab5b-r：5′-ccatgatcaagcagcagtcg-3′，且pcr扩增程序为：94℃热变性3min；94℃，40s、63℃，40s、72℃，40s，35个循环；最后72℃延伸10min。

15、优选地，所述步骤五的凝胶试剂盒为tiangel midi purification kit。

16、一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab 5b的应用，包括以下步骤：

17、s1：小g蛋白strab 5b基因的表达谱分析；

18、s2：strab 5b蛋白的保守结构域分析；

19、s3：超表达strab 5b基因马铃薯的获得；

20、s4：rab 5b基因正向调控马铃薯对晚疫病的抗性水平；

21、所述s1包括马铃薯不同组织中strab 5b基因的表达分析和接种晚疫病后strab5b基因的诱导表达分析。

22、优选地，所述s3包括strab 5b基因表达载体构建和马铃薯遗传转化和转基因植株的鉴定，所述s4分为晚疫病菌孢子液的制备、人工接种晚疫病菌、接病后超表达strab 5b基因植株的抗病性研究、strab 5b基因超表达植株接种后过氧化氢的积累和rab 5b沉默烟草植株的抗病性鉴定。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

24、目前已经证明植物小g蛋白能够调控植物的抗病性，本发明从马铃薯中克隆得到小g蛋白基因strab 5b，通过人工接种晚疫病菌，确定strab 5b基因在马铃薯晚疫病抗病性中的重要作用。

技术特征：

1.一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab 5b的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab5b的克隆方法，其特征在于，所述步骤一中选用马铃薯品种底西瑞的组培苗，在ms固体培养基中生长40d后收集叶片组织。

3.根据权利要求1所述的一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab5b的克隆方法，其特征在于，所述步骤二中通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。

4.根据权利要求3所述的一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab5b的克隆方法，其特征在于，所述步骤二中用nano drop2000超微量分光光度计测定rna浓度。

5.根据权利要求1所述的一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab5b的克隆方法，其特征在于，所述步骤三中反转录试剂盒为hiscript 1st strand cdna synthesis kit。

6.根据权利要求1所述的一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab5b的克隆方法，其特征在于，所述步骤四中引物为strab5b-f：5′atgggttgcgcatcttcagc-3′和strab5b-r：5′-ccatgatcaagcagcagtcg-3′，且pcr扩增程序为：94℃热变性3min；94℃，40s、63℃，40s、72℃，40s，35个循环；最后72℃延伸10min。

7.根据权利要求1所述的一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab5b的克隆方法，其特征在于，所述步骤五的凝胶试剂盒为tiangel midi purification kit。

8.根据权利要求1-7所述的一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab 5b的应用，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的一种马铃薯抗性小g蛋白基因strab 5b的应用，其特征在于，所述s3包括strab 5b基因表达载体构建和马铃薯遗传转化和转基因植株的鉴定，所述s4分为晚疫病菌孢子液的制备、人工接种晚疫病菌、接病后超表达strab 5b基因植株的抗病性研究、strab 5b基因超表达植株接种后过氧化氢的积累和rab 5b沉默烟草植株的抗病性鉴定。

技术总结
本发明公开了一种马铃薯抗性小G蛋白基因StRab 5b的克隆方法及应用，涉及克隆技术领域，包括以下步骤：步骤一：收集叶片组织，提取总RNA；步骤二：检测RNA的完整性；步骤三：利用反转录试剂盒，将其反转录为cDNA；步骤四：以cDNA为模板，用引物进行PCR扩增；步骤五：PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒纯化后，克隆到pEASY‑Blunt Cloning vector载体中，转化大肠杆菌DH5α后进行测序；步骤六：利用软件DnaMan软件进行序列分析，获得StRab 5b基因ORF全部序列，cDNA全长为603bp，编码200个氨基酸，本发明从马铃薯中克隆得到小G蛋白基因StRab 5b，通过人工接种晚疫病菌，确定StRab 5b基因在马铃薯晚疫病抗病性中的重要作用。

技术研发人员：张之为,田再民,张键,赵君,康丽茹,高婧,张文兵,杨佳乐
受保护的技术使用者：内蒙古农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5