一种通过微分散供气促进微生物固碳合成有机酸的方法

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种通过微分散供气促进微生物合成有机酸的方法。

背景技术：

1、利用生物体系开展碳捕捉和封存是一种环境友好的碳减排技术。利用生物法厌氧固定co2替代现有的化学法用于有机酸合成，可作为工业co2废气减排及高值转化的有效手段，具有重要的环境与经济价值。co2从气相中被传递到液相主体中溶解，然后溶解的co2通过被动扩散进入细胞内，并被胞内过碳酸酐酶(ca)转化为hco3-，接着在相关酶系催化下，hco3-参与合成相关有机酸。但是，由于常压下co2在水中溶解度极低，发酵过程中直接通入的co2气体绝大部分并未溶解而是以气泡的形式快速溢出，形成二次温室气体排放，导致丁二酸厌氧生物合成过程对co2气体利用效率极低。chen等人(化学工程，2009，37：49-52)的研究培养actinobacillus succinogenes厌氧合成丁二酸，以鼓泡的方式通入990l co2气体作为唯一co2供体，发现菌株对co2气体的实际利用效率不足3％。目前厌氧发酵固碳合成有机酸普遍以碳酸盐或碳酸氢盐作为主要的co2供体，而通入的co2气体仅起到维持厌氧状态的作用，不仅增加了发酵成本，而且积累的大量无机离子不利于产品后期提取，这已成为制约生物法低成本固碳合成有机酸的重要瓶颈。

2、wu等人(bioresource technology，2012，107：376-384)为了避免co2气体的溢出浪费，采用自吸式搅拌器将溢出的co2气体重新分散在水中，强化传质，使e.coli nzn111对co2气体的利用率大幅提升，但是依靠搅拌方式的改进并不能从根本上解决co2气体从水中快速溢出的问题，同时通过搅拌强化气液传质还会消耗大量的能量。

3、微纳米气泡是一类直径50μm～100nm的微型气泡。微纳米气泡具有常规气泡所不具备的物理与化学特性。主要表现为：气泡比表面积大，表面有较高的ζ电势，存在的表面斥力，阻碍了小气泡融合成为大气泡溢出；溶于水中气泡体积逐渐缩小，表面压力逐渐增大，使气体溶解速度加快；微纳米气泡在液体中上升速度极慢，可在液体中长时间停留。因此，本发明希望通过通入微纳米气泡促进co2在水中的溶解，并且在应用于微生物固碳合成有机酸过程中，达到提高细胞对co2气体的实际利用效率，减少对碳酸盐或碳酸氢盐的依赖的目的。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术微生物固碳发酵过程中co2在水中溶解度极低、溢出快，导致厌氧生物合成有机酸过程中对co2气体利用效率极低、依赖碳酸盐的供给等不足，提供一种采用co2微分散供气方式促进微生物厌氧发酵固碳合成有机酸的方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

3、一种通过微分散供气促进微生物固碳合成有机酸的方法，在利用菌株发酵合成有机酸的过程中，利用微纳米气泡发生器向发酵液中通入co2气体；

4、其中，所述的有机酸包括但不限于丁二酸、l-苹果酸、富马酸中的任意一种。优选的有机酸包括丁二酸、l-苹果酸或富马酸。

5、其中，所述的微纳米气泡发生器为膜管式结构，包括开门阀1、气路接口2、导气金属管3、多孔膜管4。其中，多孔膜管4的材料为陶瓷或金属材质，开门阀1、气路接口2、导气金属管3均为不锈钢材质。所述导气金属管3的远端连接有多孔膜管4，多孔膜管上的微孔孔径为50～500nm，能够在水中将通入的co2气体变成平均直径在50μm以下的气泡；所述导气金属管3的近端连接有气路接口2，通过在气路接口2的另一端接入气管，可以使得co2气体从co2气瓶经气管、气路接口2流入导气金属管3，再经多孔膜管4变成co2气泡；所述气路接口2上设置有开门阀，通过调节开门阀，能够控制通入co2气体的速率。

6、其中，所述的方法，包括如下步骤：

7、(1)将新鲜的发酵培养基加入发酵罐中，将产相应有机酸的菌株种子液接入发酵罐中，并利用微纳米气泡发生器向发酵罐中通入微纳米气泡形式的co2气体置换出空气(通常通气时间为20～30min)；

8、(2)待发酵罐中全部空气被co2气体置换完成后，关闭排气出口，维持发酵罐内绝对压力恒定，进行厌氧发酵固碳合成有机酸；

9、(3)当发酵罐中葡萄糖浓度低于1g/l以下时，停止发酵。

10、其中，步骤(1)中，微纳米气泡发生器的通气速率为0.05～0.2vvm。

11、其中，步骤(1)中，所述的菌株为具有固定co2能力和产相应有机酸能力的菌株；包括但不限于实施例中所述的产丁二酸或l-苹果酸或富马酸能力的菌株；现有技术中，只要是具有上述能力的菌株，例如经过分子改造的，可以固定co2产乳酸、丁酸、甲酸的菌株，都可以利用本发明所述的方法，通过微分散供气的方式，促进微生物固碳合成相应的有机酸。优选的，所述的菌株包括大大肠埃希氏菌escherichia coli和琥珀酸放线杆菌actinobacillus succinogenes中的任意一种更优选大肠埃希氏菌escherichia coliber208、大肠埃希氏菌escherichia coli ber108、大肠埃希氏菌escherichia coli jm125或产琥珀酸放线杆菌actinobacillus succinogenes nj113。

12、具体的，所述的产丁二酸的大肠埃希氏菌escherichia coli ber208，该菌株的详细信息已公开在专利cn102864113a中；所述的产丁二酸的产琥珀酸放线杆菌actinobacillus succinogenes nj113，该菌株的详细信息已公开在专利cn1884484a中；所述的产l-苹果酸的大肠埃希氏菌escherichia coli ber108，该菌株的详细信息已公开在专利cn102643770a中；所述的产富马酸的大肠埃希氏菌escherichia coli jm125，该菌株的详细信息已公开在专利cn101240259a中。

13、其中，当产丁二酸的菌株为大肠埃希氏菌escherichia coli ber208，所述的发酵培养基，其配方为：甜菜碱0.12g/l，(nh4)2hpo4 2.6g/l，kcl 0.15g/l，nh4h2po4 0.87g/l，mgso4 0.37g/l，fecl3 2.4g/l，cocl2 0.3g/l，cucl2 0.15g/l，zncl2 0.5g/l，na2moo40.5g/l，mncl2 0.5g/l，h3bo3 0.075g/l，葡萄糖40～100g/l。

14、当产丁二酸的菌株为产琥珀酸放线杆菌actinobacillus succinogenes nj113，所述的发酵培养基，其配方为：酵母粉5g/l，乙酸钠1.36g/l，kh2po4 3g/l，mgcl2 0.2g/l，cacl2 0.2g/l，nacl 1g/l，nah2po4 1.6g/l，na2hpo4 0.3g/l，玉米浆干粉7.5g/l，葡萄糖40～100g/l。

15、当产l-苹果酸的菌株为大肠埃希氏菌escherichia coli ber108，所述的发酵培养基，其配方为：柠檬酸3g/l，na2hpo4·12h2o4 3g/l，kh2po4 8g/l；(nh4)2hpo4 8g/l；nh4cl0.20g/l；(nh4)2so4 0.75g/l；mgso4·7h2o 1g/l；cacl2·2h2o 10mg/l；znso4·7h2o 0.5mg/l；cucl2·2h2o 0.25mg/l；mnso4·h2o 2.5mg/l；cocl2·6h2o 1.75mg/l；h3bo3 0.12mg/l；al2(so4)3 1.77mg/l；na2moo4·2h2o 0.5mg/l；柠檬酸铁(iii)16.1mg/l，甜菜碱1mmol/l，葡萄糖40～100g/l，vb1 20mg/l；生物素2mg/l。

16、当产富马酸的菌株为大肠埃希氏菌escherichia coli jm125，所述的发酵培养基，其配方为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，葡萄糖20～100g/l(单独灭菌)，115℃灭菌20min。卡那霉素30ug/l(过滤除菌)；氨苄青霉素100ug/l(过滤除菌)。

17、其中，步骤(1)中，所述的菌株种子液，其od≥4.0，接种量为5％～10％v/v。

18、具体的，当产丁二酸的菌株为大肠埃希氏菌escherichia coli ber208，所述的种子液，其od550≥4.0，接种量为5％～10％v/v。

19、当产丁二酸的菌株为产琥珀酸放线杆菌actinobacillus succinogenes nj113，所述的种子液，其od660≥4.0，接种量为5％～10％v/v。

20、当产l-苹果酸的菌株为大肠埃希氏菌escherichia coli ber108，所述的种子液，其od600≥4.0，接种量为5％～10％v/v。

21、当产富马酸的菌株为大肠埃希氏菌escherichia coli jm125，所述的种子液，其od600≥4.0，接种量为5％～10％v/v。其特征在于。

22、其中，步骤(1)中，当所述的菌株在厌氧状态下生物量od600＜3时，需要采用两阶段的发酵方法，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸，例如本发明所述的产富马酸的菌株；具体的，将步骤(1)替换为如下步骤：将新鲜的发酵培养基加入发酵罐中，将菌株种子液接入发酵罐中，向发酵罐中以0.1～0.2vvm的通气速率通入空气，当有氧培养至菌体od600＝0.8～1.0时，再用0.7mm的iptg诱导培养至od600＝3～4，然后再利用微纳米气泡发生器向发酵罐中通入微纳米气泡形式的co2气体置换出空气。

23、其中，步骤(2)中，所述的绝对压力为0.15～0.2mpa，通过调节co2的进气速率为0.01～0.12vvm，使得绝对压力恒定。

24、其中，步骤(2)中，所述的厌氧发酵，其发酵条件为：发酵温度36.5～37.5℃，搅拌速率为80～200rpm，ph 6.5～7.0。优选的发酵温度为37℃，搅拌速率为80～200rpm，ph值为6.5～6.8。

25、其中，所述的ph通过流加碱液控制，具体的，所述的碱液为koh或naoh水溶液，其浓度为5～8mol/l，优选的浓度为5mol/l。

26、有益效果：本发明提供了一种通过微分散供气促进微生物固碳合成有机酸的方法，即采用co2微分散供气方式促进微生物厌氧发酵固碳合成有机酸，与传统的常压鼓泡供气方式相比，本发明在不影响的产品生产性能的前提下，摆脱了对碳酸盐或碳酸氢盐供给的依赖，在发酵过程中不再补充任何的碳酸盐或碳酸氢盐，显著降低生物基有机酸厌氧发酵的成本，同时本发明利用微分散气泡发生器可在水中形成co2微纳米气泡，能有效促进co2在水中的溶解与分散，延缓水中co2的溢出，增加停留时间，又大幅提高了对co2气体的实际利用效率，减少发酵过程中co2气体逃逸所造成的温室气体二次排放，该方法具有较强的社会和经济价值。