一种检测铜绿假单胞菌的引物探针组合、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及微生物检测，具体涉及一种检测铜绿假单胞菌的引物探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、本节中的陈述仅提供与本技术公开相关的背景信息，并且可能不构成现有技术。

2、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，pa)为非发酵革兰阴性杆菌，是引起院内感染的常见条件致病菌，常在免疫力低下及重症患者中引起各种急性和慢性感染，致死率高。2021年度中国细菌耐药监测网(chinet)统计结果显示，在114033株呼吸道标本分离菌中，铜绿假单胞菌占第三位(13.5％)，仅次于肺炎克雷伯杆菌和鲍曼不动杆菌。铜绿假单胞菌医院感染主要集中在icu、神经外科、呼吸内科等科室，在医院感染中占有非常重要的位置，且在外科创伤感染中以该菌的检出率为最高，它不仅可引起术后伤口感染、褥疮、脓肿、烧伤后感染、化脓性中耳炎等多种疾病，还可以引起新生儿的严重流行性腹泻，该菌为条件致病菌，极易在呼吸道定植并引起感染，特别是免疫力低下的人群易感，由此可见，铜绿假单胞菌仍然是目前院内感染防治的重点和难点。

3、目前铜绿假单胞菌的检测需继续宁细菌培养，根据微生物特性进行鉴定，疑似菌落的鉴定通常需要结合使用现代技术进行鉴定，如测序技术基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)。但目前的检测方法存在检出率低、耗时长、检测结果不及时，对防治等措施无法起到及时的指导作用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对目前检测方法检测准确性低、检测结果不及时的问题，提供了一种检测铜绿假单胞菌的引物、探针、试剂盒及其应用，不仅具有特异性高、重复性好的优势，还缩短了对铜绿假单胞菌的检测时间，可快速得出准确的检测结论。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种检测铜绿假单胞菌的引物探针组合，引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示，探针序列如seq id no.3所示。

4、一种检测铜绿假单胞菌的试剂盒，包括以下组分：核酸裂解液、pa反应酶、pa反应液、阳性对照和阴性对照。所述核酸裂解液包括sds、tris-hcl、edta、nacl、np40、聚乙烯吡咯烷酮pvp等；pa反应酶包括抗体修饰taq酶、udg酶、dntps、mg离子、5×buffer等；pa反应液包括根据铜绿假单胞菌flge基因设计的扩增引物f/r(引物序列如seq id no.1和seq idno.2所示)和探针p(探针序列如seq id no.3所示)、根据人源内参基因gapdh设计的扩增引物f1/r1和探针p1、ddh2o；阳性对照和阴性对照分别为铜绿假单胞菌灭活菌悬液和无菌pbs缓冲液。本试剂盒与近缘菌、易引起相似的临床症状微生物、呼吸道感染治疗药物、潜在干扰物质血红蛋白、白细胞等均无交叉反应，特异性高、重复性好，可提供精准的诊断。本发明还提供了采用上述试剂盒检测痰液中铜绿假单胞菌的方法。

5、优选的，所述铜绿假单胞菌flge基因正向引物f的序列如seq id no.1所示，铜绿假单胞菌flge基因反向引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示，铜绿假单胞菌flge基因探针p的序列如seq id no.3所示；根据人gapdh基因保守区设计的扩增引物探针，其中正向扩增引物f1如seq id no.4所示，反向扩增引物r1如seq id no.5所示，探针p序列如seq idno.6所示。

6、铜绿假单胞菌的探针p荧光标记为fam；gapdh探针p1荧光标记为hex。

7、优选地，阳性对照的为浓度为1×105cfu/ml的铜绿假单胞菌(cmcc 10104)菌悬液经加热灭活处理后分装。

8、优选地，加热灭活条件为60℃，60min；阴性对照为无菌pbs缓冲液。

9、优选地，上述方案中所述的核酸裂解液组分配置包括：sds的浓度为2％、tris-hcl的浓度为100mm、edta的浓度为20mm、nacl的浓度为1.4m、np40的浓度为20mm、聚乙烯吡咯烷酮pvp的浓度为3％。

10、优选地，上述方案中所述的pa反应酶组分配置包括抗体修饰taq酶的浓度为5u/μl、udg酶的浓度为2u/μl、dntps的浓度为40mm和5×buffer。

11、优选地，上述方案中所述的pa反应液组分配置包括根据铜绿假单胞菌flge基因设计的扩增引物f/r各0.2μm和探针p为0.1μm、根据人源内参基因gapdh设计的扩增引物f1/r1各0.1μm和探针p1为0.05μm、ddh2o为10％。

12、本发明另一方面还提供如前所述的试剂盒在非诊断和治疗目的的铜绿假单胞菌检测中的应用。

13、一种检测铜绿假单胞菌的方法，包括如下步骤：

14、(1)提取核酸：将样品离心后取沉淀，加入核酸裂解液，混匀，裂解，裂解完成后离心取上清做pcr；裂解在90℃下裂解10min裂解完成；离心参数为12000rpm离心5min；

15、(2)反应液的制备：根据检测样品数配制除模板以外的混合液体并混匀，瞬时离心后分装于荧光定量pcr反应管中；

16、混合液体中包括10nμl的pa反应液和8nμl的pa反应酶；

17、其中，n为反应数，反应数n＝待测样本数n+阳性对照1+阴性对照1。

18、(3)加样：向步骤(2)中的pcr反应管中加入步骤(1)提取的dna样品、阴性对照，压紧管盖后再加阳性对照样品；

19、(4)pcr扩增；

20、(5)结果分析。

21、优选地，步骤(2)中pa反应液包括seq id no.1和seq id no.2所示的引物序列和如seq id no.3所示的探针序列；以及内参基因gapdh基因的扩增引物f1/r1和探针p1。

22、优选地，步骤(2)中pa反应酶包括抗体修饰taq酶、udg酶、dntps、mg离子、5×buffer。

23、优选地，步骤(1)中的核酸裂解液包括sds、tris-hcl、edta、nacl、np40、聚乙烯吡咯烷酮pvp。

24、优选地，所述核酸裂解液组分配置包括：2％sds、100mm的tris-hcl、20mm的edta、1.4m nacl、20mm np40、3％聚乙烯吡咯烷酮pvp。

25、优选地，步骤(4)中实时荧光定量pcr的反应条件为：预变性95℃、10min、1个循环；变性95℃、10s、40个循环；退火延伸58℃、15s、40个循环采集荧光。

26、优选地，步骤(5)中结果分析具体为：阳性(+)标准：ct值≤35，fam/hex通道扩增曲线呈s型曲线；阴性(-)标准：fam通道无数值，hex通道扩增曲线呈s型曲线。

27、本发明还提供如前所述的引物探针组合或如前所述的检测方法在非诊断和治疗目的的铜绿假单胞菌检测中的应用。

28、与现有的技术相比本发明的有益效果是：

29、1、一种快速检测铜绿假单胞菌感染的引物，从大量的引物、探针中筛选出具有高灵敏度和高特异性的引物探针，与近缘菌(嗜麦芽假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌等)、易引起相似的临床症状微生物(肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等)、呼吸道感染治疗药物、潜在干扰物质血红蛋白、白细胞等均无交叉反应，特异性高、重复性好；

30、2、一种检测铜绿假单胞菌的引物、探针、试剂盒及其应用，本发明选用人员内参基因gapdh作为内参照，可以质控“采样、提取、扩增”导致的假阴性。同时，pa反应酶中加入了防污染的ung酶，在基因扩增前有效消除基因扩增片段污染，确保结果的准确性和可靠性；

31、3、一种检测铜绿假单胞菌的引物、探针、试剂盒及其应用，本发明使用企业参考品多次验证试剂盒的阴阳性符合率、检出限以及为期20天的精密度试验，综合评价试剂盒批内/批间、日内/日间、不同操作者以及不同仪器之间的精密度，以保证试剂盒检测结果的可重复性以及检测结果的再现性。同时，使用试剂盒检测临床痰液样本，同培养法进行结果一致性评价。灵敏度高，特异性强，且检测时间短，为铜绿假单胞菌感染的检测提供了更好的途径。