一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的PCR方法与流程

本发明涉及检测领域，特别是一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法。

背景技术：

1、肉制品是我国居民食品消费的重要组成部分，主要以猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉和鸭肉为主。一些不法商贩为获得高额利润，使用低价优质肉冒充高价优质肉，如根据鸭肉的纹理色泽和牛羊肉更为接近，采用牛羊肉精、肉粉或香精等对鸭肉进行浸泡，以此掩盖其掺假行为，用鸭肉冒充牛羊肉进行销售。以廉价的鸭肉冒充牛肉、羊肉进行生产经营欺骗消费者的做法，不仅损害了消费者的经济利益，同时也存在诸多的安全隐患，如过敏体质的人群因食用掺假的食品而造成过敏损伤等问题。或利用鸡、鹅等其他动物血冒充鸭血在市场上销售，因建立快速、有效的鸭源性成分检测方法对肉制品行业的监督和管理有重要意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，充分、准确在一定浓度下提取样品的dna极大的缩短了实验时间，提高了检测的准确性。

2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，包括以下步骤：

3、s1、称取样品，研磨混匀制得试样，提取试样的dna模板；

4、s2、制备体积为25μl的pcr扩增产物，所述pcr扩增产物包括dna模板2μl，10×pcr缓冲液2.5μl，dntp 2.0μl,上、下游引物各1μl,taq dna聚合酶0.5μl,加双蒸水补足25μl；

5、s3、设阳性对照、阴性对照、空白对照；

6、s4、将s2中制得的所述pcr扩增产物于94℃预变性2min，94℃变性30s,68℃退火30s,72℃延伸40s,30个循环，最后72℃延伸5min，反应完成后在4℃下保存；

7、s5、制备2％的琼脂糖凝胶并加入核酸染料至终浓度为0.5μg/ml，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚没过琼脂糖凝胶，将各pcr扩增产物分别和上样缓冲液混合，点样，加入合适的dna分子标记，恒压，电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶2/3后，凝胶成像仪下观察电泳结果并记录；

8、s6、电泳结果出现可疑阳性时，将所述pcr扩增产物进行dna测序。

9、本发明中，制备pcr扩增产物时，加入的dna模板为2μl，模板量增加，更能使扩增过程更敏感，扩增效果更佳。

10、在本发明的一个优选实施例中，s1中提取试样的dna模板的方法为：取试样于离心管内，加入裂解液，65℃裂解60min，离心，转移上清于离心管中，加入三氯甲烷—异戊醇混匀，离心后取上清液，加入异丙醇沉淀，离心，弃上清液，洗涤，晾干，

11、加入50μl灭菌双蒸水溶解沉淀，制备试样的dna模板。

12、本发明中，裂解时间为60min，提取样品的dna浓度可以更好的满足实验要求。

13、在本发明的一个优选实施例中，所述试样、所述裂解液、所述三氯甲烷-异戊醇的重量体积比为50mg：600μl～800μl：400μl。

14、在本发明的一个优选实施例中，所述上清液与所述异丙醇的重量比为1：0.8。

15、在本发明的一个优选实施例中，所述离心的转速为12000r/min，所述离心的时间为5min，所述洗涤采用浓度为75％乙醇。

16、在本发明的一个优选实施例中，s2中所述pcr缓冲液中mg2+的质量浓度为20mmol/l，所述dntp的质量浓度为2.5mmol/l,所述上、下游引物的浓度为10pmol/l，所述taq dna聚合酶的浓度为2u/μl。

17、在本发明的一个优选实施例中，s3中所述阳性对照为已知含有鸭成分的样品与待检样品等量混合，s3中所述阴性对照为已知不含鸭成分的样品，s3中所述空白对照为采用与dna模板等体积的双蒸水作为空白对照。

18、在本发明的一个优选实施例中，s5中所述核酸染料为4s-green plus无毒核酸染料，s5中所述上样缓冲液为1μl 6×loading buffer上样缓冲液。

19、本发明中，采用4s-green plus无毒核酸染料，安全无毒，增加实验的安全性。

20、在本发明的一个优选实施例中，s5中所述各pcr扩增产物的量为5μl，s5中所述上样缓冲液的量为1μl。

21、与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：

22、1、本发明中，选取最优的裂解时间，更能充分、准确在一定浓度下提取样品的dna。

23、2、本发明对反应试剂和时间等经过改进，安全无毒的同时，极大的缩短了实验时间，提高了检测的准确性。

技术特征：

1.一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，s1中提取试样的dna模板的方法为：取试样于离心管内，加入裂解液，65℃裂解60min，离心，转移上清于离心管中，加入三氯甲烷—异戊醇混匀，离心后取上清液，加入异丙醇沉淀，离心，弃上清液，洗涤，晾干，加入50μl灭菌双蒸水溶解沉淀，制备试样的dna模板。

3.如权利要求2所述的一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，所述试样、所述裂解液、所述三氯甲烷-异戊醇的重量体积比为50mg：600μl～800μl：400μl。

4.如权利要求2所述的一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，所述上清液与所述异丙醇的重量比为1：0.8。

5.如权利要求2所述的一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，所述离心的转速为12000r/min，所述离心的时间为5min。

6.如权利要求2所述的一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，所述洗涤采用浓度为75％乙醇。

7.如权利要求1所述的一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，s2中所述pcr缓冲液的中mg2+的质量浓度为20mmol/l，所述dntp的质量浓度为2.5mmol/l,所述上、下游引物的浓度为10pmol/l，所述taq dna聚合酶的浓度为2u/μl。

8.如权利要求1所述的一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，s3中所述阳性对照为已知含有鸭成分的样品与待检样品等量混合，s3中所述阴性对照为已知不含鸭成分的样品，s3中所述空白对照为采用与dna模板等体积的双蒸水作为空白对照。

9.如权利要求1所述的一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，s5中所述核酸染料为4s-green plus无毒核酸染料，s5中所述上样缓冲液为1μl 6×loading buffer上样缓冲液。

10.如权利要求1所述的一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的pcr方法，其特征在于，s5中所述各pcr扩增产物的量为5μl，s5中所述上样缓冲液的量为1μl。

技术总结
本发明公开了一种改进食品及饲料中鸭源性成分检测的PCR方法，包括以下步骤：S1:称取样品，研磨混匀制得试样，提取试样的DNA模板；S2、制备体积为25μL的PCR扩增产物；S3、设阳性对照、阴性对照、空白对照；S4、将S2中制得的PCR扩增产物于变性、退火、延伸，反应完成后在4℃下保存；S5、制备琼脂糖凝胶加入核酸染料，在电泳槽中将各PCR扩增产物分别和上样缓冲液混合、点样、加入合适的DNA分子标记，恒压、电泳、凝胶成像仪下观察电泳结果；S6、电泳结果出现可疑阳性时，将PCR扩增产物进行DNA测序。本发明对反应试剂和时间等经过改进，安全无毒的同时，缩短实验时间，提高检测的准确性。

技术研发人员：张丽平,吕梦婷,崔海月
受保护的技术使用者：镇江华大检测有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17