本发明属于生物医药领域，具体涉及预防呼吸道合胞病毒感染的蛋白质及其应用。
背景技术：
：：1、呼吸道合胞病毒(rsv，respiratory syncytial virus)是全球最常见的导致婴幼儿下呼吸道感染的病原微生物之一，几乎所有儿童2岁前都会至少感染一次rsv而导致肺炎或支气管炎，甚至死亡。在免疫缺陷和免疫力低下的老年人群中，rsv感染会出现严重的下呼吸道临床症状，从而提高死亡风险。因此，开发安全有效和价格低廉的预防rsv感染疫苗，成为全世界迫切需要解决的问题之一。2、rsv属于副粘病毒科、肺病毒属，其基因组为单股负链病毒，全长15.2kb，编码11个病毒蛋白。根据rsv病毒的基因组序列，将其分为a和b两种亚型。由于rsvf蛋白具有较强保守性的特点，不同rsv亚型间差异仅有10％左右，因此f蛋白是广谱rsv疫苗设计及开发的主要抗原。3、rsvf蛋白在病毒与宿主细胞膜融合的过程中，由势能较高、稳定性较差的pre-f构象变为势能较低、相对稳定的post-f构象。在这一构象变化的过程中，pre-f特异性表位和v表位被遮挡，致使机体无法产生具有高中和活性的抗体；因此开发基于pre-f的rsv疫苗，成为预防rsv感染研究热点。目前已有临床可用的rsv疫苗，这些疫苗均是基于rsvf蛋白单体结构的基础上进行改造[krarup a.,et al.a highly stable prefusion rsv fvaccine derived from structural analysis of the fusion mechanism.naturecommunications,2015,6:8143；crank mc.,et al.a proof of concept for structure-based vaccine design targeting rsv in humans.science,2019,365,505-509.]，使其能保持pre-f的构象。然而，根据文献报道，这些蛋白疫苗均基于rsva亚型的f蛋白为基础进行改造，对病毒的保护谱有限，且存在产量较低(低于6mg/l)[joyce mg.,et al.iterativestructure-based improvement of afusion-glycoprotein vaccine againstrsv.nature structural&molecμlar biology,2016,23(9):811-820.]、无法始终保持pre-f构象等问题[crank mc.,et al.science,2019,365,505-509.]。技术实现思路1、针对现有技术中存在的问题，本发明人通过研究在于rsv b亚型的f蛋白序列进行改造而完成本发明。具体地，本发明关键设计在于:一、基于rsvb亚型的f蛋白序列，通过去除post-f特有i、iv表位序列及pre-f、post-f共有的iii表位部分序列，分别获得新f抗原序列；二、将两个或多个新f抗原序列串联在一起形成新f抗原二聚体。这两点设计使新f抗原二聚体在体内外维持在pre-f构象，从而刺激机体产生针对b亚型的pre-f表位特有的且具有高中和活性的抗体。2、本发明提供一种呼吸道合胞病毒抗原，其是去除了post-f特有的i、iv表位及pre-f、post-f共有的iii表位一部分的rsv b亚型毒株的f蛋白单体，或者两者串联一起得到的呼吸道合胞病毒抗原，优选地所述rsv b亚型毒株的f蛋白单体的一个或多个(例如，三个、四个、五个、六个)串联在一起得到的呼吸道合胞病毒抗原；3、优选地，根据rsv b9320毒株的f蛋白氨基酸序列(优选地其如seq id no：1所示氨基酸序列)，去除了n104-v147段(具体是如seq id no：2所示)和v308-s552段(具体是如seqid no：3所示)；将a103与g143直接链接，将c37突变为a，t97突变为m，s197突变为n，q202突变为r，k226突变为m，得到包含pre-f特有的v和表位、pre-f、post-f共有的ii表位和只含有v40-l45(vskgyl)氨基酸序列的iii表位的rsv b9320 f蛋白单体的氨基酸序列；4、分别所获得的新的rsv b9320 f蛋白单体串联或两种蛋白单体多个串联在一起，串联在后面的蛋白不包括m1-q26段(具体是如seq id no：4所示)，得到呼吸道合胞病毒抗原。5、优选地，去除了post-f特有的i表位的氨基酸序列为f387-d392(fnpkyd)和去除了post-f特有的i表位的氨基酸序列为k427-s436(knrgiiktfs)；及去除了pre-f、post-f共有的iii表位除氨基酸序列为v40-l45(vskgyl)以外的部分；6、更优选地，将两个或多个单体串联得到的所述呼吸道合胞b亚型病毒抗原的氨基酸序列如seq id no：5所示。7、另外，还在3'端加上标签序列和终止密码子序列；优选地，各单体之间还有连接肽。8、进一步优选地，其氨基酸序列为seq id no：5所示，或者进一步包括标签序列，优选地如其氨基酸序列为seq id no：6所示。9、本发明还提供所述的呼吸道合胞病毒抗原的编码基因；优选地，所述标签序列的编码核苷酸序列是编码6个组氨酸的核酸序列，优选地，如seq id no：6所示；进一步地，还包括所述终止密码子的编码核苷酸序列是1个终止密码子。10、优选地，其核苷酸序列如seq id no：7所示。11、本发明还提供含有所述的编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞，具体地所述重组载体的出发载体为哺乳动物细胞表达载体如pcaggs载体，所述重组宿主细胞出发宿主细胞是哺乳动物细胞如293f细胞。12、进一步提供所述的呼吸道合胞病毒抗原的编码基因。13、本发明还提供含有所述的编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞，具体地所述重组载体的出发载体为哺乳动物细胞表达载体如pcaggs载体，所述宿主细胞哺乳动物细胞如293f细胞。14、本发明还提供所述的呼吸道合胞b亚型病毒抗原的制备方法，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒抗原编码基因通过重组表达载体在宿主细胞中表达得到所述呼吸道合胞病毒抗原；具体地，所述重组载体的出发载体为哺乳动物细胞表达载体如pcaggs载体，所述宿主细胞哺乳动物细胞如293f细胞；任选地，还包括表达后收集细胞上清和纯化所述呼吸道合胞病毒抗原的步骤。15、本发明还提供以所述的呼吸道合胞病毒抗原为有效成分和佐剂组成的抗原组合物，优选地所述佐剂为铝佐剂和addavax佐剂。16、本发明也提供所述的呼吸道合胞病毒抗原在制备用于免疫动物获得抗体的试剂中的应用。17、本发明提供的二聚体抗原，不仅使其在体内外维持在pre-f构象，从而刺激机体产生针对pre-f表位特有的且具有高中和活性的抗体，具有刺激机体产生更多中和抗体的优点。另外，通过实验证实，本发明f抗原二聚体还具有产量高的优点(在实验中超过30mg/l)。当前第1页12当前第1页12