一种可以进行基因重排的大肠杆菌基因组大片段

本发明涉及生物，特别涉及一种可以进行基因重排的大肠杆菌基因组大片段。

背景技术：

1、在生物工业产业中菌种至关重要，是技术创新及市场竞争的重要保障。在生活中，菌株的利用与人们息息相关，酱油，醋，面包，酸奶都离不开菌株发酵。然而目前我国许多重要菌种依赖进口，一旦断供会造成严重影响。因此解决菌种受限问题十分重要。自然界中菌株也会发生突变，以及重排现象引起表型突变。为了得到更多突变菌株，从而筛选到需要的高产或耐受性菌株，目前人们通过紫外线照射，等离子体诱变等方式获得大量突变体。对于一些相关基因，路径明确的可以通过基因工程进行理性改造。但是随机突变产生的点突变无法产生大的结构性变异，带来的变化有限，通过基因工程进行理性改造则需要我们对物种基因解析的足够深入，往往十分困难。大肠杆菌与酿酒酵母是实验室常用的原核及真核微生物，可以快速增值，生长周期短，遗传结构明确，在生物领域有很大的应用价值。目前在酿酒酵母中通过基因组重排产生大量的高产及耐受菌株，但是在大肠杆菌中主要研究集中于对其进行定点突变，用于在代谢工程中合成特定的产品。目前我们对大肠杆菌基因组结构和功能的解析水平有限，已知的识别靶点较少，因此通过理性改造非常困难，且研究周期较长。大肠杆菌作为底盘菌株，大尺度基因组结构变异的研究较少，目前没有通过大片段合成大肠杆菌片段引入重排位点来重排产生大量结构变异的研究。本专利通过从头设计合成大肠杆菌基因组，重排产生大量大尺度基因组结构变异的菌株，从而推进对大肠杆菌基因组结构及细胞工厂设计构建的研究。

2、现有技术中将大肠杆菌基因组的程序化裂变成不同的合成染色体对并进行融合，最终得到倒置和易位的基因组(图1)。该方法首先将具有适当间隔区、lambda-red重组机制和切割细菌人工染色体(bac)的cas9引入细胞。对dna进行cas9定向切割，其中两个剪切以基因组为目标，其中四个以裂变bac为目标。切割释放出来的dna片段通过lambda-red介导的基因组片段间重组产生大片段的易位和倒置。该方法只能产生人工设计的dna倒置及易位，不能产生大量随机重排结构进行分析，且该方法操作复杂。综上，现有技术无法产生大量的有大尺度基因组结构变异的菌株，即使产生结构变异，操作十分复杂，且需要对位点进行设计，无法随机产生大量重排菌株。目前也没有从头设计合成插入重排位点的大肠杆菌基因组来进行重排的研究，无法产生大量大片段插入，缺失，倒置，易位的重排大肠杆菌菌株。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供的一种可以进行基因重排的大肠杆菌基因组大片段，可以快速大量产生产量有差异的大肠杆菌菌株，有助于在细胞工厂构建过程中快速筛选构建高产菌株。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了核酸分子，为经改造的大肠杆菌基因组片段；

4、所述大肠杆菌基因组片段由yadd基因、panc基因、panb基因、yadc基因、yadk基因、yadl基因、yadm基因、htre基因、yadv基因、yadn基因、paod基因、paoc基因、paob基因、paoa基因、yagu基因、ykgj基因、ecpe基因、ecpd基因、ecpc基因、ecpb基因、ecpa基因、ecpr基因、ykgl基因、ykgo基因、ykgm基因、ykgr基因、ykgp基因、eaeh基因、ykga基因、ykgq基因、ykgb基因、ykgi基因、ykgc基因、ykgd基因、ykge基因、ykgf基因、ykgg基因、ykgh基因、beta基因、betb基因、beti基因、bett基因、yaha基因、yahb基因、yahc基因、yahd基因、yahe基因、yahf基因、yahg基因、yahi基因、yahj基因、yahk基因、yahl基因、yahm基因、yahn基因、yaho基因、prpr基因、prpb基因、prpc基因、prpd基因、prpe基因、codb基因、coda基因、cynr基因、cynt基因、cyns基因、cynx基因、laca基因、lacy基因、lacz基因、laci基因、mhpr基因、mhpa基因、mhpb基因、mhpc基因、mhpd基因、mhpf基因、mhpe基因、mhpt基因、yail基因、frmb基因、frma基因、frmr基因、yaio基因、yaix基因、yaip基因、yais基因、taua基因、taub基因、tauc基因和taud基因组成；

5、所述改造包括：

6、(i)、移除全部noti酶切位点；和

7、(ii)、在yadd基因和panc基因之间、在panb基因和yadc基因之间、在yadc基因和yadk基因之间、在yadk基因和yadl基因之间、在htre基因和yadv基因之间、在yadv基因和yadn基因之间、在yadn基因和paod基因之间、在yagu基因和ykgj基因之间、在ykgj基因和ecpe基因之间、在ecpc基因和ecpb基因之间、在ecpb基因和ecpa基因之间、在ecpa基因和ecpr基因之间、在ykgl基因和ykgo基因之间、在ykgm基因和ykgr基因之间、在ykgq基因和ykgb基因之间、在ykgi基因和ykgc基因之间、在ykgd基因和ykge基因之间、在ykgg基因和ykgh基因之间、在ykgh基因和beta基因之间、在beta基因和betb基因之间、在betb基因和beti基因之间、在bett基因和yaha基因之间、在yaha基因和yahb基因之间、在yahb基因和yahc基因之间、在yahd基因和yahe基因之间、在yahg基因和yahi基因之间、在yahj基因和yahk基因之间、在yahk基因和yahl基因之间、在yahl基因和yahm基因之间、在yahm基因和yahn基因之间、在yaho基因和prpr基因之间、在prpb基因和prpc基因之间、在prpc基因和prpd基因之间、在prpd基因和prpe基因之间、在prpe基因和codb基因之间、在coda基因和cynr基因之间、在cynt基因和cyns基因之间、在cyns基因和cynx基因之间、在cynx基因和laca基因之间、在laca基因和lacy基因之间、在lacy基因和lacz基因之间、在lacz基因和laci基因之间、在laci基因和mhpr基因之间、在mhpb基因和mhpc基因之间、在mhpe基因和mhpt基因之间、在mhpt基因和yail基因之间、在yail基因和frmb基因之间、在frmb基因和frma基因之间、在frma基因和frmr基因之间、在frmr基因和yaio基因之间、在yaip基因和yais基因之间、在taua基因和taub基因之间分别插入loxpsym位点；

8、所述大肠杆菌为escherichia coli str.k-12substr.mg1655。

9、在本发明的一些具体实施方案中，上述核酸分子序列如表1所示。

10、本发明还提供了表达载体，包括上述核酸分子，以及可接受的基因元件。

11、本发明还提供了宿主细胞，包括如下一项或多项：

12、(i)、上述核酸分子；(ii)、上述表达载体；(iii)、质粒；

13、所述宿主细胞包括酵母或大肠杆菌；

14、所述质粒具有：

15、(1)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或

16、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个基因获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

17、(3)、如(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或若干个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)或(2)的相同或相似；或

18、(4)、与如(1)至(3)任一项所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

19、所述多个为2个至5个；

20、所述若干个为2个至50个。

21、在本发明的一些具体实施方案中，上述核酸分子中所述loxpsym位点的序列具有：

22、(9)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或

23、(10)、如(9)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(9)的相同或相似；或

24、(11)、与如(9)至(10)任一项所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至5个。

25、本发明还提供了经改造的大肠杆菌，所述改造包括：

26、(a)、删除自panc基因始至mhpe基因的片段，包括panc基因和mhpe基因；或

27、(b)、删除自yadc基因始至taua基因的片段，包括yadc基因和taua基因；或

28、(c)、删除自yadc基因始至yadk基因的片段、yadn基因始至ykgg基因的片段、prpe基因始至mhpe基因的片段，包括yadc基因、yadk基因、yadn基因、ykgg基因、prpe基因和mhpe基因；或

29、(d)、删除自yahi基因始至yahk基因的片段、prpd基因始至mhpb基因的片段，包括yahi基因、yahk基因、prpd基因和mhpb基因；或

30、(e)、删除自yadk基因始至frmr基因的片段，包括yadk基因和frmr基因；或

31、(f)、删除自yadk基因始至cynx基因的片段、lacy基因始至frmr基因的片段，包括yadk基因、cynx基因、lacy基因和frmr。

32、本发明还提供了上述核酸分子、上述表达载体或上述宿主细胞在制备用于构建大肠杆菌突变菌株的试剂或试剂盒中的应用。

33、本发明还提供了试剂，包括可接受的辅料或助剂，以及如下任意项：

34、(i)、上述核酸分子；和/或

35、(ii)、上述表达载体；和/或

36、(iii)、上述宿主细胞。

37、本发明还提供了试剂盒，包括上述试剂，以及可接受的辅料或助剂。

38、本发明还提供了上述核酸分子的制备方法，包括如下步骤：

39、步骤(a)：将所述核酸分子的序列以小片段依次进行合成，获得待组装片段；

40、步骤(b)：取包含步骤(a)所述的待组装片段的载体转化酵母，获得环形质粒；

41、步骤(c)：取步骤(b)所述的环形质粒转化大肠杆菌，富集，提取质粒，将获得的环形质粒进行酶切，获得大片段；

42、步骤(d)：取步骤(c)所述的大片段分别转化原生质体，将原生质体进行融合，获得所述核酸分子。

43、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法中所述小片段的长度为2500～3500bp。

44、本发明的大肠杆菌基因组大片段有如下效果：

45、1.本发明合成的大肠杆菌100kb片段含有52个loxpsym位点利用cre-loxp随机产生大量有结构变异的大肠杆菌重排菌株，方法简单，易于操作，且非重排是随机发生的，未经人工设计，更有利于进行更广阔的基因组结构功能探索。

46、2.本发明理性设计从头合成大肠杆菌100kb基因组，有助于更好的对大肠杆菌基因组结构功能进行研究。

47、3.本发明利用番茄红素作为表征，快速大量产生产量有差异的大肠杆菌菌株，有助于在细胞工厂构建过程中快速筛选构建高产菌株。