一种人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体为一种人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备及其应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(ad)是一种与衰老相关的神经退行性疾病，是21世纪卫生保健面临的重大挑战之一，目前还没有有效的治疗方法。它对老年人口的健康构成了迫在眉睫的威胁，随着全球人口老龄化的空前增长，如果不加以控制，ad将成为社会日益加重的负担。ad的临床表现为初始阶段的偶然遗忘，最终发展为轻度认知障碍到全面的ad，并在记忆、计划和组织等认知功能方面有明显的困难。ad晚期患者不仅认知功能严重下降，并伴有严重的组织病理学变化，人格和行为也可能发生剧烈变化，最终无法独立完成日常功能。

2、随着人口寿命的延长，阿尔茨海默病代表着日益加重的公共卫生负担。事实上，流行病学研究表明，ad的总体流行率预计将在未来20年内翻一番。在确诊后，一个人的平均寿命为4-8年，极少数情况下可达20年。然而，患者在疾病的后期需要全面护理。因此，ad对全球医疗保健系统也有重大的财务影响。如果不找到有效的干预措施，预计到2030年，阿尔茨海默病的护理费用将达到2万亿美元左右，全球将有7500万人受到影响。到目前为止，还没有治愈的方法，目前的治疗方法也没有有效地延缓进展。多奈哌齐是一种胆碱酯酶抑制剂和fda批准的药物，是目前最常见的治疗轻度到重度ad的药物。这种药物通过抑制乙酰胆碱在突触中的分解，提高乙酰胆碱的可用性，增加大脑中的神经元传输。与安慰剂治疗相比，该治疗对一些ad患者的认知功能和日常活动有一定的益处。然而，多奈哌齐有严重的副作用，停用该药的患者会加速认知能力下降。因此，迫切需要更好地了解ad的病理生理学，以便开发有效的治疗方法。在各种神经系统疾病中，最常见的机制是神经元细胞的进行性退变和死亡，由于中枢神经系统内源性再生的固有局限性，神经元细胞永远不会被自然取代。此外，目前的药物选择都不能防止和减缓神经元不可逆破坏的进展。现在，唯一正确的策略是细胞治疗，特别是基于干细胞的治疗。然而，人脐带间充质干细胞在生物活性的维持、生物活性物质的定量以及临床治疗中的物流递送方面具有相对的局限性。

3、一种被称为外泌体的细胞外小泡的新成员被认为是一种有前途的无细胞疗法，因为它们具有多种生物活性和细胞间通讯的功能。近年来，众多研究小组证明，从人脐带间充质干细胞中分离的外泌体具有独特的形态和功能特征，是治疗多种疾病的新方法。根据国际细胞外泡学会(isev)的研究，根据来源、大小和载物，细胞外泡可分为三类，包括外泌体、微泡和凋亡小体。外泌体不同于直接从质膜和凋亡过程中形成的凋亡小体中萌发的微泡，它具有内体起源。外泌体是多泡体(mvb)与质膜融合的产物。多泡体(mvb)是细胞内的多泡腔室，由内体膜内陷产生。外泌体在绵羊网织红细胞成熟过程中是大小相对均匀的颗粒。后来发现，不仅大多数细胞，如神经元、上皮细胞、内皮细胞和干细胞分泌外泌体，而且一些细胞，包括免疫细胞和间充质干细胞(mscs)也比其他细胞产生更多的外泌体。此外，外泌体存在于各种体液中，包括血液、尿液、唾液、羊水、母乳、滑液、支气管肺泡灌洗液和脑脊液。外泌体是纳米尺度的囊泡(40-150nm)，能够很好地逃脱被吞噬细胞吞噬，外泌体的生物学来源显著降低免疫反应，与脂质体等纳米药物递送系统相比，外泌体具有更强的生物相容性，对细胞增殖、免疫调节和许多其他功能起作用。在临床治疗中，外泌体表达了人脐带间充质干细胞的所有优点，并避免了它们的缺陷。它们也更容易被量化并在保存和运输中保持其生物活性。

4、脐带间充质干细胞衍生的外泌体转移大量治疗因子，并表现出无致瘤性、低免疫原性、突出的自我更新和免疫调节特性。由于来源于人类，脐带间充质干细胞衍生的外泌体在未来的临床治疗中似乎更容易被医生和患者接受，助于推进干细胞外泌体的ad临床治疗应用转化。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备及其应用，能够有效减轻阿尔茨海默病症状。

3、(二)技术方案

4、一种人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备，所述制备方法如下：

5、(1)人脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定：无污染脐带剥离静脉、动脉及华通氏胶后，置于培养基中培养至p4代；p4代人脐带间充质干细胞置于光学显微镜下观察；

6、(2)人脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定：p4代人脐带间充质干细胞置于含有5％血清替代物的完全培养基中培养48～72h，再通过离心取上清液，使用外泌体提取试剂盒提取人脐带间充质干细胞外泌体；使用透射电子显微镜、蛋白质印迹检测进行鉴定。

7、优选的，所述步骤(1)中培养基培养条件为以3ml/瓶接种于含10ml培养基的t-75培养瓶中，置37℃，5％二氧化碳的饱和湿度环境下培养，5d后换液，以后每4d换液1次，观察细胞达90％局部融合后，0.25％胰酶消化2min，按1*106/t-75密度传代，继续培养至p4代。

8、优选的，所述步骤(2)中离心操作为收集细胞上清至离心管中，以2000rpm的转速离心10min，然后以10000rpm的转速离心30min，去除细胞或者细胞碎片。

9、优选的，所述外泌体注射液由外泌体和生理盐水组成，每毫升注射用水中含有1×105个人脐带间充质干细胞产生的外泌体。

10、优选的，所述人脐带间充质干细胞外泌体用于治疗阿尔茨海默病，减轻阿尔茨海默病症状。

11、优选的，所述人脐带间充质干细胞外泌体治疗app/ps1转基因小鼠，提高阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力，减轻认知功能障碍。

12、优选的，所述人脐带间充质干细胞外泌体有效提高阿尔茨海默病小鼠的运动能力，改善运动耐力。

13、(三)有益的技术效果

14、本发明是提供一种人脐带间充质干细胞分泌的外泌体治疗阿尔茨海默病的技术手段，减轻阿尔茨海默病症状。

15、本发明是利用间充质干细胞来源的外泌体治疗app/ps1转基因小鼠，提高阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力，减轻认知功能障碍。

16、本发明是利用间充质干细胞来源的外泌体改善阿尔茨海默病小鼠焦虑情绪。

17、本发明可以有效地提高阿尔茨海默病小鼠的运动能力，改善运动耐力。

18、本发明制备间充质干细胞外泌体的原料来源是脐带，其制备成本低廉，采集方便，为无创性操作，脐带来源丰富，可以进行规模化生产。

技术特征：

1.一种人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备，其特征在于：所述制备方法如下：

2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备，其特征在于：所述步骤(1)中培养基培养条件为以3ml/瓶接种于含10ml培养基的t-75培养瓶中，置37℃，5％二氧化碳的饱和湿度环境下培养，5d后换液，以后每4d换液1次，观察细胞达90％局部融合后，0.25％胰酶消化2min，按1*106/t-75密度传代，继续培养至p4代。

3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备，其特征在于：所述步骤(2)中离心操作为收集细胞上清至离心管中，以2000rpm的转速离心10min，然后以10000rpm的转速离心30min，去除细胞或者细胞碎片。

4.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备，其特征在于：所述外泌体注射液由外泌体和生理盐水组成，每毫升注射用水中含有1×105个人脐带间充质干细胞产生的外泌体。

5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞外泌体用于治疗阿尔茨海默病，减轻阿尔茨海默病症状。

6.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞外泌体治疗app/ps1转基因小鼠，提高阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力，减轻认知功能障碍。

7.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞外泌体有效提高阿尔茨海默病小鼠的运动能力，改善运动耐力。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，且公开了一种人脐带间充质干细胞外泌体注射液制备及其应用，无污染脐带剥离静脉、动脉及华通氏胶后，置于培养基中培养至P4代，置于含有5％血清替代物的完全培养基中培养后离心取上清液，外泌体提取试剂盒提取人脐带间充质干细胞外泌体；外泌体注射液由外泌体和生理盐水组成，每毫升注射用水中含有1×10<supgt;5</supgt;个人脐带间充质干细胞产生的外泌体。有效提高阿尔茨海默病的学习记忆能力，减轻认知功能障碍，改善阿尔茨海默病小鼠焦虑情绪，提高阿尔茨海默病小鼠的运动能力，改善运动耐力。

技术研发人员：李双,孙璐瑶,张佳燚,刘喜富,刘心星,王宁眉,曹津萌,刘风清
受保护的技术使用者：张家口健垣精准医学有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7