一种先天性巨大黑痣动物模型的构建方法及其应用

本发明属于转基因生物，具体涉及黑色素细胞特异性表达nrasq61k突变基因的一种先天性巨大黑痣模型小鼠的构建方法及其应用。

背景技术：

1、先天性黑色素细胞痣(congenital melanocytic nevi,cmn)是指出生时即有或出生后几周内出现的黑痣，相关研究报道其在新生儿中的发病率约为1％-6％，当cmn累及成年患者体表长径＞20cm时称为先天性巨大黑色素细胞痣(giant congenital melanocyticnevi,gcmn)，其发病率约为1/20000。gcmn最大可累及超过80％患儿体表面积，往往严重影响患儿容貌，导致患儿严重的自卑心理，此外，gcmn的终身恶变几率可高达5％-15％。同时，约3％-12％的gcmn患者同时伴有痣细胞累及中枢神经系统，称为神经皮肤黑变病(neurocutaneous melanosis,ncm),该病目前无有效的治疗手段，一旦出现神经系统症状，患者往往3年内死亡。

2、gcmn病理生理改变主要表现为真皮层内大量痣细胞增殖聚集，目前对于其形成机制仍未完全明确。大量研究认为nras突变是gcmn患者中最常见的驱动突变，carbel等报道，nras突变是lgcmn中唯一的可重复出现突变。martins da silva等在gcmn研究中进行了靶向测序，发现57.1％的患者存在nras突变。且gcmn中发现的nras基因突变主要集中于61号密码子，即nrasq61k/r。以往对于gcmn等这一类涉及体表大部皮肤的良性肿瘤的治疗手段极其有限，手术切除几乎是唯一途径。近几年靶向治疗领域的研究进展给这类良性肿瘤的治疗带来新曙光。然而，目前国内外gcmn的动物模型有限，给gcmn的发病分子机制、治疗靶点探究、靶向药物开发带来极大限制。

3、由于先天性巨大黑痣是一种罕见病，因此对于其动物模型的构建进展缓慢。2005年，ackermann等在构建恶性黑色素瘤模型小鼠的过程中偶然发现，将小鼠黑色素细胞选择性表达nrasq61k突变基因后，小鼠出现黑色素细胞大量增殖，全身变黑的表现，接近人类的先天性巨大黑痣表型。2022年，choi等将敲入lsl-nrasq61r的转基因小鼠和黑色素细胞特异性启动子(dct/tyr)cre小鼠杂交，获得先天性巨大黑痣小鼠模型。然而现有的动物模型都存在不同的缺陷，ackermann等构建的小鼠模型将nrasq61k基因序列构建入tyr(hs3.6/6.1)-lacz载体后，注射入b6d2f1(f1[c57bl/6j×dba/2])小鼠受精卵中，为随机转基因的构建策略，插入位点随机，拷贝数随机，进行后续实验需要进行建系，需要建立至少两株不同品系进行交叉验证，方案费时费力，构建结果不确定性大。同时其繁配方案中引入两种品系小鼠(c57bl/6j和dba/2)，背景更为复杂。choi等的构建方案对黑色素细胞的选择性依赖于dct/tyr-cre小鼠，繁配方案复杂，且其使用的突变基因为nrasq61r。

技术实现思路

1、为克服现有技术中存在的问题和缺陷，本发明提出了一种稳定、高效、简便的先天性巨大黑痣小鼠模型的构建方法及应用，构建更为贴近临床、稳定、繁配简便的先天性巨大黑痣小鼠模型。本发明的发明人在首个中国人群先天性巨大黑痣患者全外测序研究中发现，中国人群先天性巨大黑痣患者中nrasq61k的发生率远高于nrasq61r(约为其两倍)，基于此，本发明人首次创新提出了构建更符合中国人遗传背景的nrasq61k突变基因的先天性巨大黑痣小鼠模型。

2、本发明提出了一种nrasq61位点突变的先天性巨大黑痣小鼠模型的构建方法，所述方法为采用crispr/cas9技术，获得可进行条件下过表达tyr-lsl-nrasq61k基因的h11定点敲入小鼠模型。

3、所述方法中，采用crispr/cas9技术，通过同源重组的方式，在h11基因位点定点插入tyr-lsl-nras(q61k)-wpre-polya表达框。

4、所述方法中，采用crispr/cas9技术，将nrasq61k突变基因和黑色素细胞特异性酪氨酸酶tyr基因启动子序列及lsl序列重组。

5、所述方法中，所述重组黑色素细胞特异性酪氨酸酶基因tyr启动子序列与nras(q61k)突变基因间插入loxp-stop-loxp(lsl)序列。

6、所述方法中，与所述nras(q61k)突变基因重组的为黑色素细胞特异性酪氨酸酶基因tyr启动子序列。

7、所述方法中，所述nrasq61位点突变包括nrasq61k突变和/或nrasq61r突变。优选地，为nrasq61k突变。其中，所述nrasq61k突变的序列如seq id no.1所示。所述nrasq61r突变的序列如seq id no.2所示。所述brafv600e突变序列如seq id no.3所示。

8、在具体实施方案中，本发明提出了一种以中国gcmn患者携带的主要驱动基因nrasq61k为基础，构建黑色素细胞选择性表达nrasq61k突变基因的小鼠模型的方法。本发明采用crispr/cas9技术，将中国先天性巨大黑痣患者最常见的nrasq61k突变基因和黑色素细胞特异性酪氨酸酶(tyr)基因启动子序列重组后转入小鼠中，构建黑色素细胞特异性表达nrasq61k突变基因的转基因小鼠，即先天性巨大黑痣模型小鼠，其具有和先天性巨大黑痣临床患者相同的致病基因和相似的表型。本发明为临床先天性巨大黑痣的病因学研究，以及为进一步的靶向治疗策略的选择提供了良好的研究工具。

9、本发明构建方法，包括以下步骤：

10、(1)通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和grna；

11、(2)通过无缝克隆(in-fusion cloning)的方法构建同源重组载体(donorvector)，该载体包含5.0kb 5’同源臂、tyr-lsl-nras(q61k)-wpre-polya和3.7kb 3’同源臂；

12、(3)将cas9 mrna、grna和同源重组载体显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠；

13、(4)将pcr扩增及测序鉴定阳性的f0代小鼠与c57bl/6j小鼠交配，繁育获得阳性f1代小鼠；

14、(5)将阳性f1代小鼠和dpp3-cre小鼠杂交获得剪切lsl片段的f2代小鼠，即目标nrasq61位点突变的先天性巨大黑痣小鼠模型。

15、本发明中，还可以构建nrasq61r、brafv600e位点突变的先天性巨大黑痣小鼠模型。

16、所述方法中，将h11位点插入tyr-lsl-nras(q61k)-wpre-polya基因的f1代小鼠和dpp3-cre小鼠杂交，获得双阳性f2代小鼠，该小鼠中lsl片段被剪切，仅在黑色素细胞条件性表达nrasq61k突变基因，即获得所述先天性巨大黑痣小鼠模型。

17、在具体实施方案中，所述构建方法中，通过体外转录方式获得cas9 mrna和grna。

18、在具体实施方案中，所述构建方法中，通过无缝克隆(in-fusion cloning)方法构建同源重组载体(donor vector)；其中，所述载体包含5.0kb 5’同源臂、tyr-lsl-nras(q61k)-wpre-polya和3.7kb 3’同源臂。

19、在具体实施方案中，所述构建方法中，采用crispr/cas9技术，通过同源重组的方式，在h11基因位点定点插入tyr-lsl-nras(q61k)-wpre-polya表达框。

20、在具体实施方案中，将cas9 mrna、grna和同源重组载体显微注射到小鼠受精卵中。

21、本发明还提出了所述方法构建得到的先天性巨大黑痣小鼠模型。优选地，为nrasq61位点突变的先天性巨大黑痣小鼠模型。更优选地，为nrasq61k突变的的先天性巨大黑痣小鼠模型。所述nrasq61k突变的序列如seq id no.1所示。还可以构建得到如seq idno.2所示nrasq61r突变的先天性巨大黑痣小鼠模型。还可以构建得到如seq id no.3所示brafv600e突变的先天性巨大黑痣小鼠模型。

22、本发明还提出了所述先天性巨大黑痣小鼠模型在研究疾病病理机制、筛选靶向治疗药物、制备靶向治疗药物中的应用。所述应用中，优选地，为nrasq61位点突变的先天性巨大黑痣小鼠模型。更优选地，为nrasq61k突变的的先天性巨大黑痣小鼠模型。所述nrasq61k突变的序列如seq id no.1所示。还可以是如seq id no.2所示nrasq61r突变、如seq idno.3所示brafv600e突变的先天性巨大黑痣小鼠模型。

23、在具体实施方案中，以中国gcmn患者携带的主要驱动基因nrasq61k为基础，构建黑色素细胞选择性表达nrasq61k突变基因的小鼠模型。

24、本发明还提出了一种引物，其为5’同源臂pcr鉴定引物，其为tgggagtccagtgaacatgc(5'—>3')(如seq id no.4所示)。

25、本发明还提出了一种引物，其为3’同源臂pcr鉴定引物，其为tgcccctttgtgttctcttgtag(5'—>3')(如seq id no.5所示)。

26、本发明还提出了一种用于构建先天性巨大黑痣动物模型的繁殖方法，其将h11位点插入tyr-lsl-nras(q61k)-wpre-polya基因的f1代小鼠和dpp3-cre小鼠杂交，获得双阳性f2代小鼠，该小鼠中lsl片段被剪切，仅在黑色素细胞条件性表达nrasq61k突变基因，即先天性巨大黑痣模型小鼠。

27、本发明有益效果包括：本发明构建的小鼠模型携带中国人先天性巨大黑痣中最常见的突变基因nrasq61k，因此和人先天性巨大黑痣有类似的发病机制和更接近的表型。以往的研究显示，先天性巨大黑痣主要携带nrasq61位点的体细胞突变。本发明发明人前期对大样本量的中国先天性巨大黑痣患者的全外显子测序研究发现，中国患者群体中nrasq61突变发生率高达78.8％。该位点的突变可分为nrasq61k和nrasq61r，而中国患者群体中nrasq61k发生率约为nrasq61r的2.3倍。

28、本发明构建的小鼠模型采用h11位点定点敲入突变基因，h11位点(也叫hipp11)位于小鼠第11号染色体，是eif4enif1与drg1这两个基因之间的一个位点，由simonhippenmeyer于2010年发现并命名。由于h11位点位于两个基因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。同时h11位点所在的eif4enif1与drg1这两个基因的侧翼序列区域具有广泛的空间和时间est(expression sequence tag)表达模式，能够使整合在此的外源基因受指定启动子的驱动而稳定表达。因此本发明中的构建方法相对随机转基因构建策略的构建方案，位点和拷贝数明确，结果更为稳定，繁配更为简便。

29、常规条件性过表达的转基因小鼠，一般情况下，通过定点敲入带有lsl片段的靶基因，再与目的细胞特异性的cre小鼠杂交而获得。本发明构建的小鼠模型通过将突变基因重组到黑色素细胞特异性基因tyr的启动子序列后，从而让小鼠黑色素细胞特异性表达敲入基因，本发明方法更为稳定可靠，也繁育也更为简便快捷。

30、本发明构建的小鼠模型，在胚胎发育过程中黑色素细胞开始分化的过程便启动突变基因表达，更好地模拟了人类先天性巨大黑痣的发病过程，在研究疾病发生机制、探索靶向治疗方法具有重要作用。