大鲵金属硫蛋白AdMT基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及大鲵金属硫蛋白admt基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法。

背景技术：

1、金属硫蛋白(metallothionein，mts)是一类富含半胱氨酸(cys)，能够与重金属结合的低分子(6-7kda)多肽，普遍存在于微生物、高等动植物和人体中。1957年marghes和vallee在研究金属生物学作用时，从动物器官分离出一种新蛋白质，它含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子，此物质称为金属硫蛋白(简称mt)。金属硫蛋白是一种重要、奇异，生理功能强的活性物质，被誉为生命的守护神之一。目前，国内市场上常见的金属硫蛋白主要是从兔肝中提取，有关兔肝金属硫蛋白的提取技术通常采用肌肉或腹腔注射方法诱导刺激机体，在肝脏中产生大量金属硫蛋白，该方法注射操作繁琐，提取成本高、收率低、品质纯度差等弊端；另外，采用兔肝提取金属硫蛋白，由于金属硫蛋白原料需求特别，且生产工艺复杂，生产量存在着严重的不足、资源有限，从而使其应用和研究受到限制。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供大鲵金属硫蛋白admt基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法，以至少解决现有技术存在的生产工艺复杂、资源有限的问题。

2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

3、本发明的一方面在于提供了一种大鲵金属硫蛋白admt，所述大鲵金属硫蛋白admt的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明的另一方面在于提供了一种大鲵金属硫蛋白admt的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、本发明的再一方面在于提供了一种包含上述的大鲵金属硫蛋白admt的编码基因的重组表达质粒sumo-admt。

6、进一步，所述大鲵金属硫蛋白admt的编码基因插入到表达载体pet28a-sumo的酶切位点bamhi和xhoi之间，并用t4dna连接酶连接。

7、本发明的又一方面在于提供了一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌含有上述重组表达质粒sumo-admt，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌rosetta(de3)。

8、本发明的又一方面在于提供了一种引物，所述引物用于上述的编码基因，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述反向引物如seq id no.5所示。

9、本发明的又一方面在于提供了上述大鲵金属硫蛋白admt原核表达方法，包括以下步骤：

10、根据大鲵肝脏mt基因序列的orf区设计引物，以mt基因逆转录得到的cdna为模板，用所述引物进行pcr反应，所得的pcr产物经液体胶回收纯化；

11、将纯化后的pcr产物连接到pgem-t载体上，并转化至trans 5α大肠杆菌感受态细胞中，完成编码基因的克隆；

12、将大鲵金属硫蛋白admt的编码基因插入到表达载体pet28a-sumo的酶切位点bamhi和xhoi之间，并用t4dna连接酶连接，得到重组表达载体sumo-admt，

13、将重组表达载体sumo-admt转化至rosetta(de3)大肠杆菌感受态细胞中，获得重组基因工程菌；

14、将重组基因工程菌以1:100接种至含硫酸卡那霉素和氯霉素双抗的lb培养基中扩大培养，培养条件为37℃，200rpm，加入iptg使终浓度为0.5mm诱导蛋白表达，37℃诱导4h后，离心收集菌体。

15、本发明的最后一方面在于提供了admt-sumo融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法如下：将上述重组表达质粒sumo-admt转化至rosetta(de3)大肠杆菌感受态细胞中，以1:100接种至含硫酸卡那霉素和氯霉素双抗的lb培养基中扩大培养，加入iptg使终浓度为0.5mm诱导蛋白表达，收集菌体超声破碎后，离心收集上清，利用镍柱，经低浓度咪唑梯度洗杂、高浓度洗脱，得到纯化后的admt-sumo融合蛋白。

16、进一步，所述低浓度咪唑梯度洗杂为2mm、5mm、10mm、20mm、25mm咪唑梯度洗杂，所述高浓度洗脱为100mm咪唑洗脱。

17、本发明的大鲵金属硫蛋白admt基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法，从大鲵肝脏中提取总rna，并进行逆转录反应，合成cdna，进行引物设计，以逆转录得到的cdna为模板，进行pcr反应，将pcr产物连接到pgem-t载体上，并转化至trans 5α大肠杆菌感受态细胞中，完成编码基因的克隆，随后，将大鲵金属硫蛋白admt的编码基因插入到表达载体pet28a-sumo的酶切位点bamhi和xhoi之间，并用t4dna连接酶连接，构建重组表达载体sumo-admt，再将重组表达载体sumo-admt转化至rosetta(de3)大肠杆菌感受态细胞中，获得重组基因工程菌，将重组基因工程菌接种至含硫酸卡那霉素和氯霉素双抗的lb培养基中，使用iptg诱导蛋白表达。经评测，本发明的大鲵金属硫蛋白属于亲水性蛋白质，且具有高度保守的特点。本发明使用的大鲵肝脏原材料易得。

18、本发明的含admt-sumo基因的菌株，在无重金属存在的情况下生长无明显差异，对cd2+和zn2+的各浓度条件下都有良好的耐受能力，且本发明的admt-sumo基因增强了大肠杆菌对cd2+和zn2+重金属的耐受性。本发明的大鲵金属硫蛋白在1000μg/ml以内的浓度下，48h内，对l929和hacat细胞均不具有毒性作用，且具有极显著的促进细胞增殖的作用，在100～500μg/ml的范围内，对细胞的增殖效果尤为显著，在伤口愈合过程中，相关细胞的增殖起到至关重要的作用，因此，可以初步认为admt-sumo融合蛋白对伤口愈合具有一定的修复潜力，同时，admt-sumo融合蛋白对于lps诱导的raw264.7细胞炎症模型具有良好的治疗效果。

技术特征：

1.大鲵金属硫蛋白admt，其特征在于，所述大鲵金属硫蛋白admt的氨基酸序列如seqid no.1所示。

2.大鲵金属硫蛋白admt的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seqid no.3所示。

3.一种包含权利要求2所述的大鲵金属硫蛋白admt的编码基因的重组表达质粒sumo-admt。

4.根据权利要求3所述的重组表达质粒sumo-admt，其特征在于，所述大鲵金属硫蛋白admt的编码基因插入到表达载体pet28a-sumo的酶切位点bamhi和xhoi之间，并用t4dna连接酶连接。

5.重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌含有权利要求3或4所述重组表达质粒sumo-admt，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌rosetta(de3)。

6.一种引物，其特征在于，所述引物用于扩增如权利要求2所述的编码基因，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述反向引物如seq id no.5所示。

7.如权利要求1所述的大鲵金属硫蛋白admt原核表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.admt-sumo融合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法如下：

9.根据权利要求8所述admt-sumo融合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述低浓度咪唑梯度洗杂为2mm、5mm、10mm、20mm、25mm咪唑梯度洗杂，所述高浓度洗脱为100mm咪唑洗脱。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及大鲵金属硫蛋白AdMT基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法，从大鲵肝脏中提取总RNA，并进行逆转录反应合成cDNA，进行引物设计，以逆转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，将PCR产物连接到PGEM‑T载体上，并转化至Trans 5α大肠杆菌感受态细胞中，完成编码基因的克隆，将大鲵金属硫蛋白AdMT的编码基因插入到表达载体pET28a‑SUMO的酶切位点BamHI和XhoI之间，并用T<subgt;4</subgt;DNA连接酶连接，构建重组表达载体SUMO‑AdMT，再将重组表达载体SUMO‑AdMT转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，获得重组基因工程菌，将重组基因工程菌接种至含硫酸卡那霉素和氯霉素双抗的LB培养基中，使用IPTG诱导蛋白表达。本发明以大鲵肝脏为原材料获取大鲵金属硫蛋白AdMT基因，材料易得，工艺简单。

技术研发人员：郝林英,骆建林,李灿,随坤宇,王明波,黄青青,高强,李泽旭,华雪
受保护的技术使用者：贵阳学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17