与布鲁氏菌毒力相关的蛋白、基因及其在评价布鲁氏菌毒力、制备减毒布鲁氏菌中的应用

本发明属于生物，涉及布鲁氏菌，特别是指与布鲁氏菌毒力相关的蛋白、基因及其在评价布鲁氏菌毒力、制备减毒布鲁氏菌中的应用。

背景技术：

1、布鲁氏菌病（brucellosis）简称布病，是一种严重危害人类健康的动物源性人畜共患传染病，由革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌——布鲁氏菌（brucella）引起。人患布病后，主要表现为发热、关节炎、心内膜炎、肾小球肾炎、结节性红斑、转氨酶升高等，严重者可丧失劳动力。动物感染后，主要引起母畜流产、早产、不孕和公畜睾丸炎、附睾炎等症状，给畜牧业带来巨大经济损失。疫苗免疫是防控该病的主要途径。我国目前主要使用减毒活疫苗预防该病，如用于山羊和绵羊的m5-90和rev.1，用于牛的s19和rb51，以及用于猪的s2等。

2、布鲁氏菌没有典型的外毒素，其毒力主要表现为在宿主细胞内持续感染的能力。布鲁氏菌的宿主靶细胞有巨噬细胞、胎盘滋养层细胞和树突状细胞。在布鲁氏菌胞内存活过程中，外膜蛋白、脂多糖、转录调控因子等一些参与调控的基因会影响布鲁氏菌的毒力，如缺失gntr基因可以使布鲁氏菌的转录调控能力减弱进而下调其毒力。专利cn109652429a公开了一种与布鲁氏菌毒力相关的基因，该基因为核糖体蛋白的基因；布鲁氏菌是没有典型毒力因子的病原，其毒力主要依赖于其逃避宿主免疫应答并在宿主细胞内持续存活的能力。因此，影响布鲁氏菌毒力的因素有多重，为了进一步探索影响布鲁氏菌毒力的因素，进行了深入的探索。

技术实现思路

1、本发明提出一种与布鲁氏菌毒力相关的蛋白、基因及其在评价布鲁氏菌毒力、制备减毒布鲁氏菌中的应用，首次证实发现布鲁氏菌iv型分泌系统效应蛋白bspl与布鲁氏菌毒力相关，对于布鲁氏菌新型疫苗的研发，具有潜在的应用价值。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、分泌蛋白bspl在调控布鲁氏菌毒力中的应用，其特征在于：所述分泌蛋白bspl的氨基酸序列如seq id no.10所示。

4、一种与布鲁氏菌毒力相关的基因，所述的基因为编码分泌蛋白bspl的基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、本发明还提出了所述的与布鲁氏菌毒力相关的基因bspl在布鲁氏菌毒力评价中的应用。以及所述的与布鲁氏菌毒力相关的基因bspl在制备减毒布鲁氏菌中的应用。

6、本发明还提出了一种布鲁氏菌毒力基因检测试剂盒，含有用于扩增编码布鲁氏菌分泌蛋白bspl的基因的引物以及pcr试剂，所述的基因为编码布鲁氏菌分泌蛋白bspl的基因，其核苷酸序列如seq id no .1所示。

7、所述的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.9所示。

8、本发明还提出了一种毒力减弱的布鲁氏菌所述的布鲁氏菌的基因组中不含有编码布鲁氏菌分泌蛋白bspl的基因。

9、所述的毒力减弱的布鲁氏菌通过以下方法制备得到：

10、（1）自杀质粒的构建

11、以布鲁氏菌基因组dna为模板，使用引物bspl-n-f、bspl-n-r和bspl-c-f、bspl-c-r分别进行pcr，扩增bspl基因n端、c端同源臂；利用融合pcr方法，以bspl基因n端、c端同源臂的pcr扩增产物为模板，使用引物bspl-n-f和bspl-c-r，将两个片段进行融合，切胶回收融合片段。用 xhoi和 saci双酶切pgem-7zf（+）载体，回收酶切后的载体，连接融合片段，将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布氨苄抗性lb平板，筛选阳性克隆菌，扩大培养后，提取质粒，获得pgem-bspl载体。用 saci酶切pgem-bspl质粒，切胶回收酶切后的产物。以枯草芽孢杆菌为模板，使用引物sacb-n和sacb-c扩增sacb基因，切胶回收后连接pgem-bspl载体，将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布氨苄抗性lb平板，筛选阳性克隆菌，扩大培养后，提取质粒，获得自杀质粒pgem-bspl-sacb。

12、其中bspl-n-f的核苷酸序列如seq id no.2所示、bspl-n-r的核苷酸序列如seqid no.3所示；bspl-c-f的核苷酸序列如seq id no.4所示、bspl-c-r的核苷酸序列如seqid no.5所示。sacb-n的核苷酸序列如seq id no.6所示、sacb-c的核苷酸序列如seq idno.7所示。

13、（2）自杀质粒的电转化及bspl基因缺失株的筛选与鉴定

14、将自杀质粒pgem-bspl-sacb电转入布鲁氏菌2308感受态细胞中，涂布氨苄抗性平板，获得克隆菌，对克隆菌扩大培养，涂布含有蔗糖的平板，获得阳性克隆，对筛选到的候选缺失株传代培养，检测其稳定性。利用引物bspl-n和bspl-c完成pcr鉴定，选取阳性基因缺失菌株扩大培养后保存，得到的布鲁氏菌bspl基因缺失株，命名为2308δbspl。

15、引物bspl-n的核苷酸序列如seq id no.8所示、引物bspl-c的核苷酸序列如seqid no.9所示。

16、上述的毒力减弱的布鲁氏菌在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。

17、本发明具有以下有益效果：

18、本发明提出了一种新的与布鲁氏菌毒力相关的基因，通过敲除该基因构建了布鲁氏菌bspl基因缺失株2308δbspl，实验证明bspl基因的缺失没有对布鲁氏菌的生长造成显著影响。缺失株2308δbspl与亲本株相比，宿主细胞内存活能力在感染后0h和4h无显著变化，但在感染后8h、12h、24 h和48h时缺失株胞内存活能力显著降底。感染小鼠第2周时，2308和2308δbspl感染小鼠的脾重均呈相似趋势。在感染后第4周、6周和8周时，2308δbspl感染小鼠脾重与亲本株相比均呈显著下降的趋势。2308δbspl所感染小鼠与2308感染小鼠相比在感染后第4周、6周和8周时脾脏载菌量均呈显著下降的趋势，表明布鲁氏菌分泌蛋白bspl与布鲁氏菌的毒力相关。通过对该基因的检测，能够对布鲁氏菌的毒力进行评价，并且通过敲除该基因或降低该基因的表达水平能够制备获得减毒的布鲁氏菌，本发明的提出为布鲁氏菌新疫苗的研发提供了新的技术手段。

技术特征：

1.分泌蛋白bspl在调控布鲁氏菌毒力中的应用，其特征在于：所述分泌蛋白bspl的氨基酸序列如seq id no.10所示。

2.编码权利要求1所述的蛋白的基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.权利要求2所述的基因在评价鲁氏菌毒力中的应用。

4.基于权利要求2所述的基因的评价布鲁氏菌毒力的试剂盒，其特征在于：包括用于检测序列如seq id no.1所示的基因的特异性引物对、2×es taq mastermix、dntp以及ddh2o。

5.根据权利要求4所述的评价布鲁氏菌毒力的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物对包括序列如seq id no.8、seq id no.9所示的核苷酸序列。

6.一种毒力减弱的布鲁氏菌，其特征在于：所述布鲁氏菌不含有权利要求2所述的基因。

7.权利要求5所述的毒力减弱的布鲁氏菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

8.根据权利要求7所述的毒力减弱的布鲁氏菌的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中扩增bspl基因n端同源臂的引物对为bspl-n-f/bspl-n-r，扩增bspl基因c端同源臂的引物对为bspl-c-f/bspl-c-r，融合pcr采用的引物对为bspl-n-f/bspl-c-r；其中bspl-n-f的核苷酸序列如seq id no.2所示、bspl-n-r的核苷酸序列如seq id no.3所示；bspl-c-f的核苷酸序列如seq id no.4所示、bspl-c-r的核苷酸序列如seq id no.5所示。

9.根据权利要求7所述的毒力减弱的布鲁氏菌的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中pcr扩增采用的引物对为sacb-n/sacb-c，其中sacb-n的核苷酸序列如seq id no.6所示、sacb-c的核苷酸序列如seq id no.7所示。

10.权利要求6所述的毒力减弱的布鲁氏菌在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，涉及布鲁氏菌，特别是指与布鲁氏菌毒力相关的蛋白、基因及其在评价布鲁氏菌毒力、制备减毒布鲁氏菌中的应用。本发明利用同源重组和基因敲除的方法，删除了布鲁氏菌2308分泌蛋白BspL，构建了布鲁氏菌BspL基因缺失株2308ΔBspL。BspL基因缺失后并不会对2308的生长产生影响，但能显著下调亲本株2308在小鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠脾脏内的生存能力。2308ΔBspL中将BspL基因回补后，其毒力能够恢复到亲本株水平，证实BspL基因是布鲁氏菌2308的毒力相关基因。本发明的提出预示该毒力基因可用于布鲁氏菌减毒疫苗的研发，具有潜在的应用价值。

技术研发人员：李志强,王书利,韩进诚,杨广礼,施传信,席丽,张进良,崔艳艳,郝俊芳
受保护的技术使用者：商丘师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17