一种具有粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于荧光探针，具体涉及一种具有粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、缺血性中风(is)以脑局部缺血缺氧为特征，导致神经功能缺损和残疾，随着全球人口老龄化，已成为一个重要的公共卫生问题。早期识别is是改善及时干预和预后的关键。线粒体功能障碍是缺血后对葡萄糖和缺氧最直接的反应，与is后的早期事件密切相关，包括活性氧(ros)介导的氧化应激、n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)和谷氨酸诱导的兴奋性毒性。大量研究证明，维持线粒体功能对神经元的活动和生存至关重要。

2、粘度是微环境中反映蛋白质、脂质、多糖等物质的流动状态的一个重要参数，对细胞内生物分子之间的信号传递和相互作用具有重要意义。线粒体作为细胞器的能量供应细胞的有特定粘度(63cp)，而异常线粒体粘度可能影响执行功能的线粒体粘度的增加减少电子传递链的活动，紧随其后的是凋亡和自噬。粘度异常粘度与疾病密切相关，如阿尔茨海默病(ad)、糖尿病、癌症和is。因此，原位监测线粒体粘度的变化对于了解细胞功能的表现和阐明is的发展机制具有重要意义。

3、半胱氨酸(cys)是一种含硫氨基酸，占蛋白质组成的2％。线粒体中的cys还通过脂肪酸氧化、氨基酸分解、有氧代谢和磷酸化等化学反应参与能量的产生和传递。此外，研究人员发现cys衍生物n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)具有作为溶栓治疗is的溶栓药物，这是一种临床常用的抗氧化药物。因此，监测线粒体cys动态变化的反应性成像工具的发展有助于is的研究。

4、荧光成像技术具有操作简单、选择性好、灵敏度高、实时原位分析等优点，已成为生物医学研究中不可缺少的检测方法。在荧光成像技术的基础上，开发了一系列用于成像的荧光探针。然而，目前还没有能同时检测粘度和生物硫醇的近红外探针，这些荧光探针的响应指标主要为ph、硫醇还原酶、金属蛋白酶、一氧化氮、过氧亚硝酸盐离子、fe2+、h2s和粘度。虽然这些探针为is荧光成像提供了可视化工具，但大多数都存在长荧光发射波、小斯托克位移和单指标检测等问题。

5、针对目前的不足，本发明旨在设计和合成一种具有粘度和cys(nvcp)特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针，用于原位追踪is过程中粘度和cys的时空分布。

技术实现思路

1、本发明通过分子设计，合成出了一种具有粘度和cys特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针nvcp，并进一步提供了探针nvcp的制备方法和应用。本发明目标探针，无特别说明均用nvcp替代。

2、为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种具有粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针，探针的分子式为c37h38n5o4s+，结构式如下：

4、

5、一种粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针的制备方法，包括以下制备步骤：

6、(1)将500mg4-甲基喹啉、521mg对氨基苯甲醛和960mgzn(oac)2混合在5ml乙酸酐中，在氮保护下在150℃下回流5h；冷却至室温后，用饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷萃取去除乙酸酐，收集有机相，通过真空蒸馏得到粗产物，以体积比为1:1的ch2cl2/

7、石油醚为洗脱液，经色谱层析纯化，得到浅黄色粉末化合物3，化合物3的结构式为：

8、

9、(2)500mg将化合物3、434mg4-羟基苯乙基溴溶解在10ml乙腈中，在80℃下搅拌过夜；溶剂在减压下浓缩以得到粗产品，粗产物以体积比＝5：1的ch2cl2/ch3oh为洗脱液进行色谱层析纯化，得到紫色粉末nvcd，nvcd的结构式为：

10、

11、(3)将396mg化合物nvcd、276mg碳酸钾溶解于10ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，在室温氮保护下激活30min，然后加入579mg化合物5，加热至55℃过夜反应；所得到的混合物依次用乙酸乙酯和饱和盐水洗涤；用体积比为5:1的ch2cl2/ch3oh作为洗脱液进行柱层析纯化，得到紫色粉末终产物荧光探针nvcp。

12、进一步的，步骤(3)化合物5的结构式为：

13、本发明探针nvcp的合成路线为：

14、

15、一种粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针的应用，利用荧光光谱仪检测水环境中的粘度和cys；所述探针利用共聚焦荧光显微镜检测离体活细胞环境中的粘度和cys，以获取中间信息。

16、本发明荧光探针nvcp，可特异性定位于细胞线粒体。向细胞内加入一定量的莫能菌素，随后加入探针和碧云天商用线粒体定位剂(绿色)共同培养，能检测到探针的荧光信号和线粒体定位剂(绿色)的荧光信号重叠。

17、本发明荧光探针本身无荧光，与cys反应后在592nm荧光增强，线性范围为0–400μm，检测限为37nm；与gly反应在695nm处荧光强度逐渐增强，粘度从1.4cp变化到834cp，表现出22倍的荧光增强，且log i695 nm与logη荧光在0.5～2.0之间的曲线图呈直接线性关系，该探针表现出很高的灵敏度；该荧光探针在ph 4.1-6时显示出微弱的荧光发射，而在ph7.0-9.0时表现出显著的荧光增强，这与生理ph范围相一致；该荧光探针对粘度和cys表现出很好的选择性，不受其他干扰物的影响。

18、与空白组对比，经n-乙基马来酰亚胺(nem，硫醇阻断剂)预处理后的细胞荧光信号明显降低，而添加了cys的nem细胞的荧光强度明显强于nem组的细胞，说明nvcp对细胞内cys肯定敏感。经莫能菌素(moe)或制霉菌素(nys)预处理后的细胞比仅加载nvcp的对照组细胞表现出更强的红色荧光信号，这些结果表明了nvcp在活细胞中检测外源性/内源性cys的敏感性。

19、有益效果

20、本发明的一种具有粘度和cys特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针nvcp在粘度和cys存在下荧光发生显著变化，可以用于高灵敏度的检测粘度和cys，同时，并表现出较大的斯托克斯位移、化学稳定性、优良的生物相容性和精确的线粒体定位。更为重要的是，探针nvcp可以敏感地研究离体活细胞中线粒体粘度和cys的动态变化。

技术特征：

1.一种具有粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针，其特征在于，探针的分子式为c37h38n5o4s+，结构式如下：

2.一种权利要求1所述粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

3.根据权利要求2所述粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)化合物5的结构式为：

4.一种权利要求权利要求1所述粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针的应用，其特征在于，用于检测离体活细胞环境中的粘度和半胱氨酸，以获取中间信息。

5.一种权利要求权利要求1所述粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针的应用，其特征在于，用于检测水环境中的粘度和cys。

技术总结
本发明公开一种具有粘度和半胱氨酸特异性响应的线粒体靶向近红外荧光探针及其制备方法和应用，属于荧光探针技术领域。探针的分子式为C<subgt;37</subgt;H<subgt;38</subgt;N<subgt;5</subgt;O<subgt;4</subgt;S<supgt;+</supgt;，结构式如下：。在本发明中，基于扭曲分子内电荷转移TICT和替代重排传感机制的选择性，设计了一种线粒体靶向的近红外探针NVCP，并表现出较大的斯托克斯位移、化学稳定性、优良的生物相容性和精确的线粒体定位。基于上述优点，NVCP可以敏感地研究活细胞中线粒体粘度和Cys的动态变化。

技术研发人员：何隆薇,刘敏慧,曾佳玉
受保护的技术使用者：南华大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25