一种赤藓糖还原酶突变体及其应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种赤藓糖还原酶突变体及其应用。

背景技术：

1、赤藓糖醇(1,2,3,4-丁四醇)，是一种白色、无味、不吸湿、无光学活性、热稳定性好且易溶于水的四碳醇，甜度为蔗糖的60％～70％，热量为0.2kcal/g，仅为蔗糖热量的5％，是一种低热量的甜味剂。因其口感清凉、不致龋齿、结晶好等优点，在食品工业领域有着较为广泛的应用。赤藓糖醇可以通过化学法和微生物发酵法合成，然而化学合成法存在生产效率低、成本高和操作危险等缺点；微生物发酵法生产过程温和且容易控制，成为现今赤藓糖醇生产的主要途径。解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica作为公认的食品安全微生物，因抗胁迫能力强、基因结构独特、可利用的底物非常广泛等优点，成为目前国内外产赤藓糖醇的主要利用菌株。

2、在解脂耶氏酵母中，赤藓糖醇通过戊糖磷酸途径(ppp)作为渗透保护剂产生得到。赤藓糖醇代谢合成途径的最后一步是经赤藓糖还原酶(er)的催化，将d-赤藓糖还原为赤藓糖醇，同时赤藓糖还原酶在催化过程中以nadph为辅因子。赤藓糖还原酶是赤藓糖醇生物合成途径最后一步中唯一的酶，被认为是整个反应的关键酶。

3、作为生产赤藓糖醇的限速酶，赤藓糖还原酶的表达与活性对于赤藓糖醇的合成效率至关重要。但是目前针对此酶进行的蛋白质工程改造工作却很少，因此获得一种催化能力提升的赤藓糖还原酶突变体，对进一步提高赤藓糖醇的产量具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术中赤藓糖醇产量低的问题，本发明提供了一种解脂耶氏酵母来源的赤藓糖还原酶突变体及其编码基因，以及在微生物发酵生产赤藓糖醇中的应用。相较于解脂耶氏酵母来源的野生型赤藓糖还原酶，本发明提供的赤藓糖还原酶突变体酶活提高了26％～44％；且所提供的含有赤藓糖还原酶突变体编码基因的高产赤藓糖醇基因工程菌其赤藓糖醇产量较单过表达赤藓糖还原酶野生型的菌株有明显的提升。

2、本发明提供了一种赤藓糖还原酶突变体，与来源于解脂耶氏酵母yarrowialipolytica的yali0f18590g基因编码的赤藓糖还原酶相比，其进行了以下位点的单点突变或组合突变：

3、(1)26号位点的赖氨酸突变成天冬酰胺；

4、(2)215号位点的甘氨酸突变成天冬酰胺；

5、(3)216号位点的苯丙氨酸突变成酪氨酸；

6、(4)295号位点的缬氨酸突变成蛋氨酸。

7、本发明将来源于解脂耶氏酵母的赤藓糖还原酶的氨基酸序列使用alphafold进行建模，并结合底物d-赤藓糖和nadph模型，使用autodock进行分子对接，选择了16个影响酶活的关键位点，进一步使用foldx对这16个位点进行突变后稳定性分析。经分子对接结合热稳定性筛选后，选取了具有较好稳定性的突变位点进行赤藓糖还原酶突变体的构建。将构建得到的赤藓糖还原酶单突变体经载体转化至escherichia coli bl21(de3)中进行表达并收集粗酶液，通过检测各赤藓糖还原酶单突变体在催化d-赤藓糖生成赤藓糖醇的过程中nadph的消耗量测定其反应酶活，由此粗筛确定了酶活正向提升的6个赤藓糖还原酶单突变体。对筛选得到的6个赤藓糖还原酶单突变体进行两两组合构建得到15个赤藓糖还原酶双突变体并对其进行反应酶活的测定，最终确定了酶活明显提升的突变体k26n、k26n/v295m、k26n/g215n、k26n/f216y。将这四种赤藓糖还原酶突变体的编码基因进一步与葡萄糖脱氢酶gdh编码基因共同构建至双表达载体中并转化至escherichia coli bl21(de3)中构建得到基因工程菌，以该基因工程菌的湿菌体为催化剂进行以d-赤藓糖为底物，以葡萄糖为辅底物生成赤藓糖醇的生物催化反应，以此探究赤藓糖还原酶突变体对赤藓糖还原酶酶活表达的影响。结果显示，相较于野生型赤藓糖还原酶，上述的四种赤藓糖还原酶突变体酶活提高1.26～1.44倍，其中赤藓糖还原酶突变体k26n/v295m酶活提升44％，相对具有最高酶活。为进一步获得高产赤藓糖醇的基因工程菌，本发明应用crispr-cas9基因编辑技术，以解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica po1g(atcc20460)为底盘菌株，将赤藓糖还原酶突变体k26n/v295m的完整基因表达框插入到底盘菌株的基因组上，并选用组合型启动子hp4d作为该表达框的启动子，实现赤藓糖还原酶突变体基因的过表达，进一步提升了赤藓糖醇的生物合成产量。

8、作为优选，所述赤藓糖还原酶突变体与来源于解脂耶氏酵母yarrowialipolytica的yali0f18590g基因编码的赤藓糖还原酶相比，其进行了下列之一的组合突变：

9、(1)26号位点的赖氨酸突变成天冬酰胺且215号位点的甘氨酸突变成天冬酰胺；

10、(2)26号位点的赖氨酸突变成天冬酰胺且216号位点的苯丙氨酸突变成酪氨酸；

11、(3)26号位点的赖氨酸突变成天冬酰胺且295号位点的缬氨酸突变成蛋氨酸。

12、作为进一步优选，所述赤藓糖还原酶突变体与来源于解脂耶氏酵母yarrowialipolytica的yali0f18590g基因编码的赤藓糖还原酶相比，其进行了以下的组合突变：26号位点的赖氨酸突变成天冬酰胺且295号位点的缬氨酸突变成蛋氨酸。

13、具体地，本发明对由氨基酸序列如seq id no.1所示的赤藓糖还原酶第26位赖氨酸突变为天冬酰胺，获得氨基酸序列如seq id no.2所示的赤藓糖还原酶突变体；或者，对由氨基酸序列如seq id no.1所示的赤藓糖还原酶第26位赖氨酸突变为天冬酰胺，同时第215位甘氨酸突变为天冬酰胺，获得氨基酸序列如seq id no.3所示的赤藓糖还原酶突变体；或者，对由氨基酸序列如seq id no.1所示的赤藓糖还原酶第26位赖氨酸突变为天冬酰胺，同时第216位苯丙氨酸突变为酪氨酸，获得氨基酸序列如seq id no.4所示的赤藓糖还原酶突变体；或者，对由氨基酸序列如seq id no.1所示的赤藓糖还原酶第26位赖氨酸突变为天冬酰胺，同时第295位缬氨酸突变为蛋氨酸，获得氨基酸序列如seq id no.5所示的赤藓糖还原酶突变体。

14、由于氨基酸序列的特殊性，任何含有本发明所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

15、本发明还提供了编码上述赤藓糖还原酶突变体的基因，所述赤藓糖还原酶突变体的编码基因的核苷酸序列优选如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9所示。由于核苷酸序列的特殊性，任何本发明所示多核苷酸的变体，只要其与前述多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

16、本发明还提供了含有所述的赤藓糖还原酶突变体编码基因的重组载体。所述重组载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，连接本发明的赤藓糖还原酶突变体核苷酸序列，均应属于本发明的保护范围。所述重组载体优选以质粒pet-28a(+)为表达载体，并将所述的赤藓糖还原酶突变体的编码基因克隆至所述的质粒pet-28a(+)。此外，当赤藓糖还原酶突变体编码基因进一步与葡萄糖脱氢酶gdh编码基因共同构建至双表达载体中时，一般可以选择以pcdf-duet(+)为双表达载体。

17、本发明还提供了含有所述的赤藓糖还原酶突变体编码基因的基因工程菌。将外源赤藓糖还原酶突变体编码基因通过基因工程技术导入到宿主细胞构建得到基因工程菌并进行表达，以获得本发明所述的赤藓糖还原酶突变体；其中，所述的宿主细胞可以是细菌、真菌、植物细胞或动物细胞，优选大肠杆菌escherichia coli bl21(de3)、解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica作为表达宿主。

18、本发明还提供了一种高产赤藓糖醇基因工程菌的构建方法，所述方法包括：以解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica po1g菌株作为底盘菌株，将所述的赤藓糖还原酶突变体的基因表达框定点插入yarrowia lipolytica po1g基因组上并进行过表达，构建得到高产赤藓糖醇基因工程菌。作为优选，选用组合型启动子hp4d作为所述基因表达框的启动子，以增强赤藓糖还原酶的表达。

19、本发明还提供了所述的赤藓糖还原酶突变体及其编码基因、重组载体、基因工程菌，或上述方法构建得到的高产赤藓糖醇基因工程菌在微生物发酵生产赤藓糖醇中的应用。

20、作为优选，所述应用包括：将赤藓糖还原酶突变体编码基因与葡萄糖脱氢酶gdh编码基因共同构建至双表达载体pcdf-duet(+)中并转化至escherichia coli bl21(de3)中构建得到基因工程菌，并以基因工程菌的湿菌体或湿菌体经破碎后制得的粗酶液为催化剂进行以d-赤藓糖为底物，以葡萄糖为辅底物生成赤藓糖醇的生物催化反应。

21、作为优选，所述应用包括：将所述高产赤藓糖醇基因工程菌接种至发酵培养基中，以甘油作为碳源，进行摇瓶发酵生产赤藓糖醇。

22、本发明的有益效果：本发明通过分子对接结合热稳定性筛选进行选点并进行定点定向突变改变蛋白质氨基酸残基，将酶活性催化中心附近氨基酸进行突变，得到了活性提高的赤藓糖还原酶突变体；与解脂耶氏酵母来源的野生型赤藓糖还原酶相比，突变体酶活提高了26％～44％。将赤藓糖还原酶突变体基因定点插入底盘菌株解脂耶氏酵母yarrowialipolytica po1g基因组上后，得到的高产赤藓糖醇基因工程菌的赤藓糖醇产量较单过表达赤藓糖还原酶野生型的菌株有明显的提升，对赤藓糖醇的工业生产具有重要意义。