抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合抗原受体及其用途的制作方法

本发明涉及一种新的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3， gpc3）的分离抗体、包含该抗体的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, car）、包含该嵌合抗原受体的细胞及其用途。

背景技术：

1、肿瘤免疫细胞疗法尤其是嵌合抗原受体t细胞（chimeric antigen receptor tcell, car-t）在治疗恶性血液肿瘤方面已取得令人瞩目的疗效，在多项针对cd19及bcma阳性的恶性血液肿瘤的临床研究中取得了巨大突破，在肝癌等实体瘤的临床前和探索性临床研究中也显示出较好的前景，为癌症患者带来了新希望。全球已有7款针对恶性血液肿瘤的car-t药物上市。

2、car-t技术结合了抗体的特异性及t细胞的杀伤效应，从而形成了一种过继性免疫的有效途径，car通常由胞外抗原结合域、铰链区、跨膜区、共刺激信号域和胞内cd3ζ信号域构成，car-t在实体瘤的治疗中通常面临疗效有限和脱靶效应等多重障碍。目前全球针对肝癌等恶性实体瘤的car-t药物研发尚处于临床试验阶段，国内外尚无相关产品上市。

3、gpc3在肝细胞癌（hcc）中高表达 (表达率约74.8%)，在肺鳞癌、卵黄囊瘤、黑色素瘤、骨肉瘤等多种恶性实体瘤中也高表达，且在健康人肝脏、肾脏、胃等正常组织均不表达（bi et al.,oncotarget 8: 52866, 2017；gao et al., clin cancer res 20: 6418,2014）。靶向gpc3的单克隆抗体在临床试验中显示出很好的安全性（abou-alfa et al., jhepatol 65:289, 2016；zhu et al., clin cancer res, 19: 920, 2013）。全球公布的首个靶向gpc3的car-t细胞治疗晚期肝癌患者的早期临床研究结果显示（shi et al., clincancer res 19: 3259, 2020），car-t疗法在肝细胞癌中具有较好的安全性，13名患者中观察到了2例部分应答，显示出一定的临床应用潜力，但在疗效上仍有很大提升空间，因此如何通过合理的药物设计提高car-t治疗肝癌等实体瘤的疗效是需要解决的一个重要技术问题。

4、与血液瘤治疗比较，car-t在实体瘤患者体内接触靶抗原的几率低，且实体瘤微环境免疫抑制性强，car-t在实体瘤患者体内的扩增达峰值远远低于在血液瘤患者中的表现，这是car-t治疗实体瘤效果不佳的重要原因，因此实体瘤治疗需要car-t具有更强的杀伤活性、体内扩增能力和持续性。

技术实现思路

1、目前已知的靶向gpc3的car分子通常采用简单的二代car设计，其共刺激信号域和胞内cd3ζ信号域都采用野生型分子。本技术发明人发现，这些分子设计可能会导致car-t与靶分子结合时无法达到免疫突触形成的最佳结合状态，或者免疫突触形成后向胞内的信号传递过强或过弱，从而影响car-t细胞在体内的存活、扩增及对肿瘤细胞杀伤性能的持续性及整个免疫系统功能的调节，最终体现为临床疗效和安全性的差异。

2、胞内信号域是car-t活化和发挥杀伤作用的基础元件，其结构设计对car-t充分活化且持续生存至关重要。每个cd3ζ信号域具有3个免疫受体酪氨酸激活基序（itam），可以进行活化信号的放大。cd3ζ信号域的3个itam共有6个酪氨酸磷酸化位点，这6个酪氨酸位点发生磷酸化的次序及数目对t细胞是否能被激活起着关键作用，并对t细胞激活后的发育分化走向起着重要作用（kersh et al., science 281: 572, 2018）。cd3ζ信号域中冗余的itam活化可以促使t细胞分化和耗竭。此外，在cd3ζ信号域的活化过程中，其近膜区的空间构象也对免疫突触的形成起着重要作用（guy et al., immunol rev 232: 7, 2009）。

3、因此，本技术申请人曾对cd3ζ信号域的近膜端和免疫受体酪氨酸激活基序的氨基酸进行突变，以改善cd3ζ信号域的信号活化强度和持续性（参考专利pct/cn2021/076247）。

4、进一步地，本发明通过将car-t细胞共表达共刺激配体cd40l，以识别杀伤cd40阳性的肿瘤细胞，并活化cd40阳性的抗原呈递细胞，最终获得疗效更优的car-t细胞。

5、因此，本发明提供一种靶向gpc3的新型car，其包含编码来自靶向gpc3的人源化scfv、cd3ζ信号域和cd40l蛋白的基因。

6、具体地，本发明提供：

7、（1）嵌合抗原受体，其包含编码来自靶向gpc3的scfv、铰链区、跨膜区、cd3ζ信号域、共刺激信号域、以及cd40l蛋白的基因；其中，

8、所述scfv具有seq id no: 1所示的氨基酸序列；

9、所述共刺激信号域来自cd28；

10、所述cd40l具有如seq id no：5所示的氨基酸序列；

11、所述cd3ζ信号域是天然cd3ζ信号域序列的如下变体之一：

12、1）将天然cd3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸v2替代成l、d9替代成e、q15替代成k；

13、2）将天然cd3ζ信号域序列中的酪氨酸磷酸化位点y90替代成f；

14、3）将天然cd3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸v2替代成l、d9替代成e、q15替代成k、以及酪氨酸磷酸化位点y90替代成f；

15、所述天然cd3ζ信号域序列是对应于np_000725.1中所列氨基酸序列第52-163位。

16、（2）根据上述（1）所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区或跨膜区来自cd8α、cd28、igg1或igg4。

17、（3）根据上述（1）或（2）所述的嵌合抗原受体，其进一步包含编码信号肽的基因。

18、（4）根据上述（1）至（3）中任意一项所述的嵌合抗原受体，其中编码cd40l蛋白的基因通过连接肽连接在cd3ζ信号域的c端。

19、（5）根据上述（1）至（4）中任意一项所述的嵌合抗原受体，其中所述cd3ζ信号域具有seq id no：3所示的氨基酸序列。

20、（6）根据上述（1）至（5）中任意一项所述的嵌合抗原受体，其包含或具有seq idno：9所示的氨基酸序列。

21、（7）一种分离的核酸，其编码上述（1）至（6）中任意一项所述的嵌合抗原抗体。

22、（8）一种载体，其包含上述（7）所述的核酸。

23、（9）一种分离的细胞，其包含上述（1）至（6）中任意一项所述的嵌合抗原抗体或上述（8）所述的载体，所述细胞不为生殖细胞或受精卵。

24、（10）根据上述（1）至（6）中任意一项所述的嵌合抗原受体、上述（7）所述的核酸、上述（8）所述的载体、上述（9）所述的细胞在制备治疗gpc3阳性的恶性肿瘤的药物中的用途。

25、（11）根据上述（10）所述的用途，其中所述药物用于制备治疗肝癌、肺癌、骨肉瘤或黑色素瘤的药物。

26、与现有car-t相比，包含本发明新型car的car-t细胞能显著提高靶向gpc3的car-t细胞在体内的杀伤能力、扩增效率和持续时间，提高杀伤肿瘤的效能，最终达到提高临床疗效和减少疾病复发的目的。