烟草NtDUF868-E5基因在烟草抗旱中的应用

本发明属于生物，具体涉及烟草ntduf868-e5基因在烟草抗旱中的应用。

背景技术：

1、干旱胁迫会导致土壤中水分严重减少，直接影响农作物的生长和发育，因为土壤中的水分无法满足植物的需求，导致植物水分亏缺，进而影响其正常的生理代谢和生长过程。同样，干旱胁迫还会加剧土壤的侵蚀和退化，导致有机质流失和土壤质量下降。此外，干旱胁迫还会影响土壤中的养分供应和吸收。由于水分不足，植物的根系无法正常吸收土壤中的养分，导致植物的营养状况下降，进而影响包括烟草在内的农作物的品质和产量。

2、烟草(nicotiana tabacum l.)在面对干旱胁迫时采取了多种生理调节机制。首先，烟草通过调节气孔的开闭来减少水分蒸腾损失，通过降低气孔密度、缩小气孔开口大小、调节气孔导度等方式实现。其次，烟草在干旱条件下抑制生长，减慢根系和地上部分的生长速度、减少叶片面积的扩展、停止或减少花芽的发育等。此外，烟草合成和积累一些脱水保护物质，如脱水保护蛋白、脂质类物质和抗氧化物质，以保护细胞结构和功能。烟草还可能调节激素水平，例如增加脱落酸(aba)的合成，促进气孔闭合和减少水分流失，并调节其他激素的平衡。此外，烟草还激活抗氧化系统，通过激活抗氧化酶、合成抗氧化物质和调节氧化还原平衡等方式，对抗氧化损伤。这些生理调节机制帮助烟草适应干旱环境，减少水分蒸腾损失，保护细胞结构和功能，并对抗氧化损伤。

3、烟草是一种重要的经济作物，其叶片是主要的收获部位。烟叶生产过程中对水分的需求量很大。研究表明，当田间持水量低于50％时，会对烟草的生长发育产生负面影响，导致烟叶产量减少和品质下降。此外，烟草在不同生长阶段对水分的需求也不同。在移栽期和旺长期，烟草对水分的需求量较大。缺水可能导致烟苗根系和叶片发育不良，进而减少叶片产量和降低品质。我国地形地貌复杂，降水量分布不均，季节性干旱情况较为常见，这对烟叶生产构成了限制性因素。虽然可以通过灌溉等保水措施来帮助烟草抵御干旱，但这也会增加烟农的种植成本。因此，研究烟草的抗旱机理，培育抗旱新品种，提高烟叶的可用性和经济效益，具有重要意义。综上所述，目前迫切需要对烟叶中调控抗旱性相关基因进行克隆、功能分析和应用研究。

技术实现思路

1、本发明发现烟草ntduf868-e5基因能通过调控叶绿素和类胡萝卜素的合成实现其对该途径的正向调节，进而显著提高烟草叶绿素和类胡萝卜素的含量，增强烟草的光合能力和降低干旱处理后ros水平，从而提高烟草抗旱能力。

2、本发明采用以下技术方案：

3、本发明首先构建了ntduf868-e5基因过表达的烟草植株，以及ntduf868-e5基因敲除的烟草植株，具体如下：

4、过表达ntduf868-e5基因烟草的制备方法，步骤为：

5、构建烟草ntduf868-e5基因的植物过表达载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得ntduf868-e5-oe(ntduf868-e5基因过表达)转基因阳性株系。

6、敲除ntduf868-e5基因烟草的制备方法，步骤为：

7、构建烟草ntduf868-e5基因的植物敲除载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得ntduf868-e5-cas(ntduf868-e5基因敲除)转基因阳性纯合株系。

8、经检测，转基因植株和野生型植株干旱胁迫后的表型特征、相对含水量、光合色素含量、光合能力、烟草叶片的ros含量、抗氧化酶活性、抗旱相关基因的表达水平，发现ntduf868-e5基因可以通过提高光合色素含量，增强烟草的光合能力，增强叶片保水能力和抗氧化能力，抑制烟草水分的过度散失和过度的膜脂过氧化来提高烟草植株对干旱胁迫的抗性。因此，上述ntduf868-e5基因过表达的转基因阳性株系为抗旱烟草。ntduf868-e5基因敲除的转基因阳性纯合株系为不抗旱烟草。

9、其中，所述ntduf868-e5基因的序列如seq id no:1所示。所述野生型烟草为k326。

10、根据上述内容可知，seq id no:1所示的烟草ntduf868-e5基因可用于培育强光合能力的烟草，以及培育抗旱烟草。

11、本发明的有益效果为：

12、本发明构建了seq id no:1所示的烟草ntduf868-e5基因过表达载体和敲除载体的转基因植株，分析了烟草干旱胁迫处理后下植株叶绿素含量、光合能力、ros水平、抗氧化酶活性和参与植物干旱相关基因的表达水平，经分析可知ntduf868-e5基因属于未知功能结构域蛋白duf868基因家族成员，能通过调控叶绿素和类胡萝卜素的合成实现其对该途径的正向调节，进而显著提高烟草叶绿素和类胡萝卜素的含量，增强烟草的光合能力和降低干旱处理后植株体内ros水平，从而提高烟草抗旱能力。

技术特征：

1.seq id no:1所示的烟草ntduf868-e5基因在提高烟草叶绿素和类胡萝卜素含量中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b，所述类胡萝卜素包括叶黄素、β-胡萝卜素、新黄质和紫黄质。

3.seq id no:1所示的烟草ntduf868-e5基因在提高烟草光合作用能力中的应用。

4.seq id no:1所示的烟草ntduf868-e5基因在提高烟草抗旱性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下内容：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述野生型烟草为k326。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，构建烟草ntduf868-e5基因的植物过表达载体，包括以下内容：酶切过表达载体，然后将seq id no:1所示的烟草ntduf868-e5基因与载体相连接，挑选阳性克隆进行菌液pcr鉴定，阳性克隆测序，验证序列正确，载体构建成功。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，seq id no:1所示的烟草ntduf868-e5基因是以烟草总cdna为模板，使用camntduf868-e5-f/r扩增得到的，其中camntduf868-e5-f：′-ggagaggacacgctcgagatgagagac tttgcttcttgtttc-3′；camntduf868-e5-r：′-ttaaagcaggactctaga ttatgtggtcttagaggcatagatc-3′；camntduf868-e5-f/r中下划线部分表示与过表达载体同源的序列；所述过表达载体为part-cam质粒。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及烟草NtDUF868‑E5基因在烟草抗旱中的应用。本发明构建了过表达和敲除SEQ ID NO:1所示的烟草NtDUF868‑E5基因的转基因植株，分析了烟草干旱处理后植株叶绿素含量、ROS水平和参与抗干旱胁迫的基因表达水平，经分析可知NtDUF868‑E5基因属于烟草DUF868基因家族成员，能通过提高烟草植株叶绿素和类胡萝卜素的含量，增强烟草的光合能力，并且降低烟草受到干旱胁迫之后体内ROS水平，防止细胞膜的膜脂过氧化强度，还能通过提高抗旱基因的表达水平，提高烟草对干旱胁迫的抵抗能力。

技术研发人员：杨永霞,曹德俊,刘彻,宋皓,乔保明,朱一鸣,黄五星,韩丹,贾玮,贾宏昉,张松涛
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29