一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的分子标记、引物对及其应用

本发明涉及保护生物学、龟鳖养殖业和分子生物学等领域，具体涉及一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的分子标记、引物对及其应用。

背景技术：

1、黄缘闭壳龟(cuora flavomarginata)是国家二级保护动物，具有极高的药用价值和观赏价值。黄缘闭壳龟主要分布在安徽、湖北和河南交界的皖西大别山区，以及安徽和浙江交界的皖南山区，福建、湖南、广东、广西和台湾地区。

2、安徽地区黄缘闭壳龟分为皖西大别山区和皖南山区两个居群，长江作为天然的地理屏障，阻隔了居群间的基因流。皖西大别山区黄缘闭壳龟主要分布于安徽大别山区及与河南、湖北的交界地带，其主要特征是：体型较短，背甲较高、呈球形，背的最高点在壳的中段，嘴呈鹰钩状，脖子呈橘红色，十分鲜艳。除冬眠期外，其他时期背甲和腹甲不能完全闭合。皖南山区黄缘闭壳龟主要分布于安徽和浙江交界的皖南山区，其主要特征是：体型较长，背高度中等，背的最高点在壳的后半段；脖子颜色大多呈橘红色或红棕色，较为暗淡，背甲和腹甲可以完全闭合。台湾地区黄缘闭壳龟主要分布于台湾的丘陵地区，其主要特征是体型较为狭长，背甲较扁，背部线条呈断续状分布，不连续；头部颜色发青；脖子一般为灰褐色，发暗无光泽。

3、虽然皖西大别山区、皖南山区以及台湾地区的黄缘闭壳龟有着上述形态学的差异，但这些差异常因环境变化而变化，有时难以仅从形态上加以鉴别。目前市场上，皖西大别山产区黄缘闭壳龟价格最高，皖南产价格中等，台湾产价格最低，常有不良商贩混淆物种产地，谋取利益，进而引发争议。

4、分子标记是一种依据物种特异遗传物质进行的鉴别技术，其特征稳定、重复性好，不受环境变化的影响。

5、因此，开发鉴别皖西大别山区、皖南山区以及台湾地区不同产地的黄缘闭壳龟分子标记具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的分子标记、引物对及其应用，本方法操作简便、结果可靠、重复性好，可以实现对皖西大别山区产黄缘闭壳龟的快速鉴定。

2、本发明具体技术方案如下：

3、本发明提供的一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的分子标记，其包括如seq id no:1所示的核苷酸序列，皖西大别山区产黄缘闭壳龟能够扩增出此核苷酸序列，皖南山区以及台湾地区产的黄缘闭壳龟不能扩增出此核苷酸序列，即非皖西大别山区产黄缘闭壳龟不能扩增出此核苷酸序列。

4、本发明提供的一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的引物对，能扩增如seq id no:1所示的核苷酸序列的引物对，包括：10-f：tgttttccccgagtctgtg，序列如seqid no:2所示；10-r：gcactattttcagcaccacc，序列如seq id no:3所示；

5、本发明提供的一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的检测试剂，其包括所述无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的引物对。

6、本发明提供的一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的试剂盒，其包括所述无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的检测试剂。

7、本发明提供的一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的方法，具体为：

8、1)、利用无损伤dna提取方法提取黄缘闭壳龟的基因组dna；

9、2)、利用无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的引物对，以步骤1)获得的基因组dna为模板进行pcr扩增，获得pcr产物；

10、3)、pcr产物进行检测，若扩增出一条950bp的特异性条带，表示受测个体为皖西大别山区产黄缘闭壳龟；若无特异性条带，表示受测个体为非皖西大别山区产黄缘闭壳龟。

11、步骤1)具体为：用灭菌的棉球棒擦拭黄缘闭壳龟皮肤表面，包括颈部皮肤、四肢夹窝皮肤、外壳皮肤等，使用dna提取试剂盒，可以获得pcr扩增所需的基因组dna。

12、步骤1)中所述黄缘闭壳龟为皖西大别山区、皖南山区或台湾地区的黄缘闭壳龟；

13、步骤2)中所述无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的引物对，为针对seq idno：1设计特异性扩增引物对，包括10-f：tgttttccccgagtctgtg，如seq id no:2所示；10-r：gcactattttcagcaccacc；如seq id no:3所示；

14、步骤2)中所述pcr扩增包括：预变性95℃，3min；变性95℃，30sec；退火57℃，30sec；延伸72℃,1min；35个循环；终延伸72℃,10min。

15、步骤2)中所述pcr扩增体系为25μl，包括：2×magic green taq supermix，12.5μl；forward primer，2μl，终浓度0.4μm；reverse primer，2μl，终浓度0.4μm；dna 1μl，终浓度50ng/μl；ddh2o，7.5μl。

16、步骤3)中，检测方法为：将得到的pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；根据1％琼脂糖凝胶电泳检测结果进行分析。

17、本发明提供的分子标记技术可以实现对皖西大别山区产黄缘闭壳龟的快速鉴定，包括所述的无损伤提取基因组dna的获得、分子标记引物设计以及pcr反应体系和pcr反应程序、扩增获得的特异片段长度及序列。本发明提供的分子标记可在皖西大别山产黄缘闭壳龟中扩增出一条950bp的特异性条带，而在皖南产和台湾产黄缘闭壳龟中不能扩增出这条特异性条带。与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明通过使用分子标记技术可以实现对皖西大别山区产黄缘闭壳龟的快速鉴定，本方法操作简便、结果可靠、重复性好，可为黄缘闭壳龟的物种鉴定提供服务。

技术特征：

1.一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括如seq id no:1所示的核苷酸序列，皖西大别山区产黄缘闭壳龟能够扩增出此核苷酸序列，皖南山区以及台湾地区产的黄缘闭壳龟不能扩增出此核苷酸序列，即非皖西大别山区产黄缘闭壳龟不能扩增出此核苷酸序列。

2.一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的引物对，其特征在于，其为扩增如seqid no:1所示的核苷酸序列的引物对；所述引物对包括：10-f，序列如seq id no:2所示；10-r，序列如seq id no:3所示。

3.一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的检测试剂，其特征在于，其包括权利要求2所述无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的引物对。

4.一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求3所述无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的检测试剂。

5.一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求2所述的无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的引物对，具体为：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：用灭菌的棉球棒擦拭黄缘闭壳龟皮肤表面，包括颈部皮肤、四肢夹窝皮肤、外壳皮肤等，使用dna提取试剂盒，可以获得pcr扩增所需的基因组dna。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述pcr扩增包括：预变性95℃，3min；变性95℃，30sec；退火57℃，30sec；延伸72℃,1min；35个循环；终延伸72℃,10min。

8.根据权利要求5或7所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述pcr扩增体系为25μl，包括：2×magic green taq supermix，12.5μl；forward primer，2μl，终浓度0.4μm；reverseprimer，2μl，终浓度0.4μm；dna 1μl，终浓度50ng/μl；ddh2o，7.5μl。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中，检测方法为：将得到的pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；根据1％琼脂糖凝胶电泳检测结果进行分析。

技术总结
本发明提供了一种无损伤鉴别皖西大别山区产黄缘闭壳龟的分子标记、引物对及其应用，其包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，皖西大别山区产黄缘闭壳龟能够扩增出此核苷酸序列，皖南山区以及台湾地区产的黄缘闭壳龟不能扩增出此核苷酸序列，即非皖西大别山区产黄缘闭壳龟不能扩增出此核苷酸序列；扩增的引物对包括：10‑F：TGTTTTCCCCGAGTCTGTG，序列如SEQ ID NO:2所示；10‑R：GCACTATTTTCAGCACCACC，序列如SEQ ID NO:3所示。本方法操作简便、结果可靠、重复性好，可以实现对皖西大别山区产黄缘闭壳龟的快速鉴定。

技术研发人员：聂刘旺,朱文瑞,宫梦梦,陈永梅,蒋军,吴敏,吴多生,章晓红,王君,王瑞,江群,班友俊,夏行权,卜兴江
受保护的技术使用者：安徽师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19